استراتژي ها و روش هاي انتقال ژن در طيور

1 ـ انتقال ژن به وسيله ي اسپرماتوزوئيدها :

در ابتداي پيشرفت تکنيک هاي ترانس ژنتيک به نظر مي رسيد که تنها اسپرماتوزوئيدها ابزار مناسب وراثت براي انتقال يک قطعه ژنتيکي خارجي به ژنوم حيوانات مي باشند . Bracket و همکارانش در سال 1971 ثابت کردند که اسپرماتوزوئيدهاي پستانداران قادرند که به DNA خارجي متصل شده و آن را در طي فرايند باروري و لقاح به تخمک ماده ها منتقل کنند . عملکرد اين روش در سال 1987 نيز براي طيور پيشنهاد شد . به طور کلي يک قطعه DNA به اسپرم باند مي شود و اين اسپر براي تلقيح ماده ها به کار مي رود و اسپرمي که تخمک را بارور مي کند ، حاوي ژن مورد نظر است که آن را به تخمک منتقل مي کند و در نهايت آن ژن مورد نظر است که آن را به تخمک منتقل مي کند و در نهايت آن ژن در جوجه هاي هچ شده بروز پيدا مي کند . اخيراً اين روش در توليد پستانداران ترانس ژنتيک به کار مي رود ، اما هنوز اطلاعات قانع کننده اي از اينکه انتقال ژن با واسطه ي اسپرم مي تواند به طور موفقيت آميزي ،ترانس ژن را به Germline منتقل کند در دسترس نيست .
( 2004 , mazaziak et al )

2 ـ روش ريز تزريق DNA :

در اين روش DNA را به کمک ميکروپيپت به درون هسته سلول ها مي فرستند . اين DNA احتمال ادغام با ژنوم سلول ميزبان را خواهد داشت . اين روش يک روش عمومي براي معرفي ژن هاي خارجي به پستانداران مي باشد ، که اغلب انتقال DNA به پيش هسته تخمک تازه بارور شده صورت مي گيرد .اما استفاده از اين تکنيک براي تزريق DNA به تخم پرندگان در مقايسه با پستانداران بسيار مشکل تر است . زيرا يک تخم تازه گذاشته شده مرغ شامل حدوداً 60/000 ـ 50/000 سلول است . بنابراين ريز تزريق DNA به طور گسترده براي تخم مرغ هاي تازه به کار نمي رود .
اما روي رويان تازه بارور شده مرغ بعد از کشتن و جمع آوري تخم ها انجام مي شود .تخم هاي ريز تزريق شده براي هچ به محيط کشت سه مرحله اي Exovo منتقل مي شوند .
(,sherman,1994 , Love et al ,2004 1998, mazaziak et al )

3 ـ انتقال ژن به کمک رترو ويروس ها :

ناقل هاي رتروويروس يکي از ناقل هاي عمومي در انتقال ژن مي باشند و مي توانند ژن هاي خارجي را به germliae طيور انتقال دهند . تکنيک هاي انتقال ژن با استفاده از رتروويروس ها به کرات براي ايجاد مرغ هاي ترانس ژنتيک به کار رفته است .زيرا تيترهاي بالاي رتروويروس ها امکان انتقال مورد نظر را به سلول هاي زيادي دارا است . به طور کلي رتروويروس ها شامل يک ژنوم از نوع RNA مي باشند که يک هسته پروتئيني که حاوي آنزيم Integrase مي باشد ، قرار دارد .
پوشش پروتئيني ويروس به گيرنده هاي ويژه روي سلول ميزبان متصل مي شود . سپس اجزاء ويروس به وسيله ي ميانجيگري گيرنده ها با استفاده از آندوستيوز به داخل سيتوپلاسم ميزبان وارد مي شود . RNA ويروسي به CDNA که مي تواند به داخل هسته منتقل شود ، کپي مي شود و CDNA با DNA سلول ميزبان يکپارچه مي شود (با استفاده از Integrase ) اين DNA متصل شده به DNA ميزبان ، به همراه سلول ميزبان همانند سازي انجام مي دهد و توارث آن نيز بر اساس ژنتيک مندلي صورت مي گيرد .
DNA ويروسي الحاق يافته به ژنوم ميزبان مي تواند يک RNA ويروسي براي سنتز و پروتئين هايي که شامل يک پليمراز ( pol ) و ( gag ) و پروتئين هاي غشايي يا بسته بندي کننده ( Env ) ايجاد مي کند . اين سه دسته پروتئين يک پوشش ويروسي جديد ايجاد مي کند و RNA ژنوم ويروسي را داخل آن بسته بندي کند .اين کمپلکس جديد به غشاء سلول ميزبان منتقل مي شود و به خارج سلول هدايت مي شود . در انواع وکتورهايي که توانايي تکثير دارنده ژن هاي ساختماني و توالي هاي بسته بندي کننده ( Packaging ) سالم و کامل هستند تا توانايي ادامه توليد ذرات ويروسي را داشته باشند که مي توانند ديگر سلول ها را آلوده کنند . بنابراين وکتورهاي رتروويروسي که قادر به تکثير هستند به آساني قادر به آلوده سازي تعداد کافي از سلول هاي زاينده و انتقال ژن مورد نظر به دومين و متعاقباً نسل هاي بعد را دارا است .اما در ايجاد طيور ترانس ژنتيک با استفاده از رتروويروس هايي که توانايي تکثير را دارند ، قادر خواهند بود که دائماً ويروس را به محيط آزاد کنند . (در اصطلاح به آنها shedder گفته مي شود ) اين امر وضعيت قابل قبولي نيست .
اما ناقل هاي رتروويروسي که توانايي تکثير ندارند ( Replication-Defective-Retroviruses ) ، به اين علت که ژن هاي pol يا gag يا env را که براي تکثير لازم است ،ندارند ، ذرات جديد ويروس هايي ناقص هستند و آلودگي محيطي را کاهش مي دهند . ناقل هايي که توانايي تکثير ندارند ، استعداد آلوده سازي سلول هاي ميزبان را دارند ، ولي توانايي ايجاد ذرات جديد ويروسي را ندارند .رتروويروس هاي ناقص يعني آنهايي که توانايي تکثير ندارند ، توانايي انتقال ژنهاي خارجي با تعداد بازهاي بيش از 10 kb را دارند .زيرا آن ها بعضي از ژن هاي ضروري براي همانند سازي خود را از دست داده اند . ناقل هاي رتروويروسي جديد متکامل تر شده اند و بر پايه ي استراتژي هاي جديد حداقل آلودگي را ايجاد مي کند . ( Bosselman,1986,1987, silter 1995 , Thoraval,1990 , et al , Cosset ) .

4 ـ انتقال مستقيم DNA به بيضه ها :

اين روش در سال 1995 توسط مارشال گزارش شد . در اين روش پتانسيل انتقال مستقيم DNA خارجي به بافت بيضه پايين است و از عوامل محدود کننده آن به شمار مي رود .( 2004 , mazaziak et al )

5 ـ انتقال ژن به کمک سلول هاي بلاستومري :

سلول هاي بلاستومري در کارهاي ترانس ژنتيکي بسيار مفيدند ، آنها به راحتي الز حيوان دهنده به حيوان گيرنده منتقل مي شوند و به راحتي در تشکيل بافت هاي سوماتيک و بافت هاي جنسي يا germline شرکت مي کنند . در محيط کشت چندين روز قابل نگهداري هستند و مي توان بيان ژن هاي انتقال يافته را در آنها قبل از انتقال به جنين در آزمايشگاه بررسي کرد . اين ويژگي هاي آنها باعث مي شود که اين سلول ها ناقل هاي ايده آلي براي تغييرات ژنتيکي جديد در germline باشند .
در اين تکنيک سلول ها استخراج مي شوند .دستکاري مي شوند و در نهايت در داخل يک رويان در حال رشد قرار مي گيرند .با اين هدف که يک جنين آميخته ( chimeric ) ايجاد شود که در germline آن ، ژن مورد نظر وجود دارد .در نهايت ايجاد نتايج G0 که اين نتايج با همديگر آميزش پيدا مي کنند تا مرغ هاي G1 را ايجاد کنند که ترانس ژن را با خود حمل مي نمايند . ( 2004 , Kamihira et al )

6 ـ انتقال ژن به کمک سلول هاي PGC (primordial germ cells).

از زماني که سلول هاي PGC به عنوان سلول هاي پايه در توليد اسپرماتوزوآ و يا تخمک شناخته شدند ، استفاده از آنها روش مفيدي در توليد طيوري ترانس ژنتيک مي باشد .سلول هاي PGC (سلول هاي جنيني اوليه ) منشأ GERMLINE در جنس طيور هستند ، اين سلول ها در مراحل ابتدايي تمايز جنيني ( مرحله ي دهم ) شروع به تمايز مي کنند و در يک منطقه خارج جنين که به هلال زاينده ( Germ crescent ) منتهي مي شود ، قابل استخراج اند .اين سلول ها از هلال زاينده به برآمدگي گنادي در جنين (Gonadol ridge )توسط دو مکانيسم مهاجرت مي کنند و در نهايت در ساختار germline شرکت مي کنند .
1 ـ به طور غيرفعال در يک گردش درون ـ خارج جنيني :( intra-extra embryonic circulation )
2 ـ به طور فعال با به وجود آمدن خون و جريان خون اين سلول ها را به اپيتليوم لايه ي زاينده مهاجرت مي کنند .
مقصد نهايي هر تغييري در ژنوم طيور سلول زاينده germline است . به اين علت که اين سلول ها سرانجام ژن انتقال يافته را به نسل هاي بعدي منتقل خواهند کرد .
سلول هاي PGC مرغ مي توانند در خارج از بدن در يک محيط کامل از عوامل رشد ، تکثير يافته و بعد از انتقال ژن به آنها در توليد طيور ترانس ژنتيک استفاده شدند .
تزريق سلول هاي PGC ورتروويروس ها و سلول هاي بلاستومري به صفحه ي زاينده در جنس مرغ در يک تخم تازه بارور شده صورت مي گيرد . با اين اميد که اين سلول هاي تزريق شده در germline جنين قرار گرفته و يک مرغ ترانس ژنتيک ايجاد شود که بتواند ژن را به نسل هاي بعدي منتقل کند .
به طور کلي انتقال ژن با استفاده از رتروويروس ها و سلول هاي PGC از روش هاي عملي و مرسوم در انتقال ژن به ژنوم طيور مي باشد ( 2004 , Mazaziak et al )
مشکل ترين مرحله در ايجاد طيور ترانس ژنتيک انتقال ژن است . موقعي که پرنده هاي G0 هچ مي شوند ايجاد لاين از آنها در مقايسه با انتقال ژن کار خيلي جزئي و ساده اي است .
منبع: فصلنامه بهداشت حيوانات،شماره 24 /س