بررسي بذر زاد بودن و تعيين علف هاي هرز ميزبان باکتري

کاووس کشاورز(مربي، عضو هيات علمي مرکز تحقيقات کشاورزي و منابع طبيعي کهکيلويه و بويراحمد) و کرم اله گودرزي (محقق مرکز تحقيقات کشاورزي و منابع طبيعي کهکيلويه و بوير احمد
تاريخ دريافت: 85/11/8
تاريخ پذيرش: 86/6/22

چکيده

اين پژوهش به منظور تعيين بذرزاد بودن باکتري عامل سوختگي برگ گندم و شناسايي علف هاي هرز ميزبان اين باکتري انجام گرفت. طي دو فصل زراعي 1376 و 1377 از مزارع مختلف گندم آبي و ديم دو استان فارس و کهکيلويه و بويراحمد نمونه برداري شد. نمونه ها روي محيط کشت KB کشت داده شد. عامل بيماري سوختگي برگ گندم بر اساس آزمون هاي LOPAT و ساير آزمون هاي بيوشيميايي و فيزيولوژيکي جدايه هاي Pseudomonas syringae pv syringae(Pss تشخيص داده شد. جهت تعيين بذرزاد بودن باکتري Pss از سه روش شستشوي سطحي، کشت مستقيم بذور و آرد بذور استفاده شد. در روش شستشوي سطحي، باکتري Pss روي هيچ کدام از دو محيط کشت KB , KBC جداسازي نگرديد. بيشترين آلودگي بذري روي محيط کشت KBC در روش مستقيم و کمترين آلودگي بذري روي رقم قدس که از مزارع کشاورزان جمع آوري شده بود، روي محيط کشت KB بدست آمد. بر اساس نتايج بدست آمده باکتري Pss (عامل سوختگي برگ گندم) قادر است به صورت بذرزاد روي بذور گندم زندگي کند و به احتمال زياد به صورت اندوفيت در بذر بسر مي برد. از بين روش هاي مورد بررسي جهت تعيين بذرزاد بودن باکتري استفاده از محيط نيمه انتخابي KBC قابل استفاده است و به آساني مي توان بر پايه مرفولوژي، رنگ کلني و آزمون اکسيداز باکتري Pss را شناسايي نمود. باکتري Pss از علف هاي هرز يک ساله نظير دم روباهي، ماشک، يولاف وحشي، جو موشي و مرغ در چند منطقه از جمله ياسوج، مرودشت و سپيدان جداسازي و بيماري زايي آن به اثبات رسيد.
واژه هاي کليدي: سوختگي برگ گندم، باکتري Pseudomonas syringae pv syringae(Pss)، اپي فيت، بذرزاد، علف هاي هرز

مقدمه

بيماري سوختگي برگ گندم ناشي از باکتري Pseudomonas syringae pv syringae(Pss) انتشار جهاني دارد و هر ساله خسارت زيادي به مزارع گندم وارد مي کند. اين باکتري علاوه بر بيماري زا بودن مي تواند به عنوان هسته يخ (INA) عمل کند و در مناطق سردسيري جلوگيري از سرمازدگي و خسارت زياد مي شود (2). در ايران تاکنون اين بيماري از مزارع گندم استان هاي کرمان، چهارمحال و بختياري و فارس گزارش شده است(1، 3، 4).
ميزان الودگي بذري ناشي از باکتري Pss روي 21 نمونه گندم زمستانه جمع آوري شده از نبراسکا و داکوتاي جنوي بين 5-2 درصد برآورد شده است. همچنين اين باکتري قادر است به صورت اپي فيت روي بذور گندم زندگي خود را سپري نمايد. اوتا و اسميت و هاتينگ، بيان کردند که باکتري Pss مي تواند در بذرهاي گندم به عنوان يک اپي فيت باقي بماند و به عنوان يک منبع مهم اينوکولوم براي توسعه بيماري در مزرعه حفظ شود. براي جداسازي عامل بيماري سوختگي برگ از بذور گواهي شده واريته گندم Sonalica که در نواحي مختلف بنگلادش کشت شده بود استفاده کرد و براي اين منظور از روش هاي استخراج مستقيم از بذرهاي کامل بوسيله روش Liquid assay، استخراج از بذرهاي رشد کرده، کشت مستقيم بذرها بر روي محيط هاي کشت نيمه انتخابي KBC و آزمون رشد (Seedling symptom test) ، استفاده کرد.
تعداد زيادي ميکروارگانيسم بيماري زا ممکن است از علف هاي هرز به عنوان ميزبان استفاده کنند و سپس به ميزبان اصلي منتقل شوند. در صورتي که کشت هاي 24 ساعته باکتري Pss جدا شده از دم روباهي که به صورت اپي فيت به سر مي برد روي گياهچه هاي اوليه گندم پاشيده شود، توليد سوختگي مي نمايد، هر چند که اين علائم شدت آلودگي طبيعي را نداشت. اين باکتري قادر است که روي علف هاي هرز حاشيه و درون مزارع از جمله دم روباهي، ماشک (Vicia villosa) و فرفيون Euphorbia pulcherrima به صورت اپي فيت زندگي کند.
پژوهش حاضر به منظور روش هاي تعيين بذرزاد بودن باکتري عامل سوختگي برگ گندم و معرفي علف هاي هرز ميزبان اين باکتري صورت گرفته است.

مواد و روش ها

طي دو فصل زراعي 1376 و 1377 نمونه هايي از برگهاي گندم و علف هاي هرز حاشيه و داخل مزارع استان هاي فارس و کهکيلويه و بويراحمد که داراي علائمي شبيه به سوختگي بودند جمع آوري و جهت بررسي به آزمايشگاه منتقل شدند. نمونه هاي مشکوک پس از شستشو با آب به قطعات 1-2 سانتي متري تقسيم و در لوله حاوي آب مقطر سترون قرار داده و نيم ساعت با شيکر دوراني بهم زده شدند. از سوسپانسيون بدست آمده يک قطره بوسيله لوپ برداشته و به محيط کشت KB انتقال داده و به کمک لوله شيشه اي خميده (ال شکل) به طور کاملاً يکنواخت در سطح محيط پخش و جهت رشد در انکوباتور 25 درجه سانتي گراد به مدت 48 ساعت نگهداري شد. پس از رشد کلني ها و با استفاده از نور ماوراء بنفش کلني هايي که توليد رنگ فلوروسنت نموده بودند، جداسازي و روي محيط کشت نوترينت آگار (NA) کشت گرديدند. پس از خالص سازي، آزمونهاي LOPAT شامل لوان، اکسيداز، لهانيدن سيب زميني، آرجي نين دي هيدرولاز و فوق حساسيت روي جدايه هايي (گندم و علف هاي هرز) که توانايي رنگ فلورسنت روي محيط KB داشتند به روش لليوت و همکاران صورت گرفت.
پس از انجام آزمون هاي LOPAT، ساير آزمون هاي بيوشيميايي و فيزيولوژيکي روي جدايه هايي که از روي علفهاي هرز جداسازي شده بودند انجام و در نهايت روي گندم مايه زني شدند. محيط کشت نيمه انتخابي مورد استفاده براي شناسايي باکتري K.B.C, PSS مي باشد که از طريق اضافه کردن اسيد بوريک، سفالکسين و سيکلوهگزامايد به محيط کشت King(B بدست مي آيد.

اثبات بيماريزايي

بذور گندم رقم تجن در هيپوکلريد سديم 2% ضد عفوني، و در گلدان هاي حاوي خاک سترون کاشته شدند سوسپانسيوني با غلظت CFU 106 (تهيه شده به روش اسپکتروفتومتري) از کشت 48 ساعته باکتري تهيه و مايه زني به روش تزريق داخل بافت برگ و پاشيدن سوسپانسيون باکتري به هر دو طرف برگ در مرحله به ساقه رفتن در گلخانه با دماي 20 درجه سانتي گراد انجام شد. پيش از مايه زني سطح برگ خراش داده شد. براي شاهد از آب مقطر سترون استفاده گرديد.
علائم بيماري به صورت لکه هاي آب سوخته، نکروز و کلروز، يک هفته بعد ظاهر شد. پس از اثبات بيماري زايي ساير آزمون هاي بيوشيميايي و فيزيولوژيکي روي جدايه هايي که از روي علف هاي هرز جداسازي شده بودند انجام گرفت.

تعيين بذرزاد بودن باکتري

بذور رقم گندم تجن و کراس آزادي که به طور مصنوعي به وسيله سوسپانسيون باکتري تلقيح شده بودند و همچنين بذور رقم قدس که از مزارع کشاورزان به طور تصادفي جمع آوري شده بود، با استفاده از روش هاي شستشوي سطحي بذور، کشت مستقيم و عصاره آرد بذور با کاربرد دو محيط کشت KB و KBC بررسي گرديدند.

روش شستشوي سطحي

هفتصد عدد بذر از هر کدام از بذور تجن، کراس آزادي و قدس در ارلن مايرهاي 250 ميلي ليتري ريخته و 25 ميلي ليتري آب مقطر سترون يک صدم درصد Tween20 به آن اضافه گرديد. نمونه ها مدت پنج دقيقه بهم زده شد. يک ميلي ليتر از سوسپانسيون مذکور با رقت ها 1-10 ، 2-10، 3-10 و 4-10 (اعداد به توان خوانده شود) و با اضافه کردن 85% نمک طعام سترون تهيه شد. نيم ميلي ليتر از هر رقت روي محيط کشت هاي KB و KBC به صورت ميله اي شکل پخش شد.

روش کاشت مستقيم

در اين روش دويست عدد بذر از ارقام تجن، کراس آزادي و قدس که در روش اول درون فلاسک ريخته شده بود، خارج و داخل يک کيسه ململ ريخته و سپس به مدت يک ساعت زير آب معمولي نگه داشته باشد. سپس بذور روي کاغذ صافي سترون زير يک هود ماوراء بنفش خشک روي محيط کشت KB , KBC درون تشتک قرار داده شد، نحوه قرار گرفتن بذرها به گونه اي بود که در هر تشتک پتري به قطر 9، 25 سانتي متر عدد بذر قرار مي گرفت.

عصاره آرد بذور

پانصد عدد بذر باقي مانده در يک خرمنکوب (blender) به آرد تبديل شد. آرد حاصله در 25 ميلي ليتر آب حاوي نمک طعام سترون (85%) در يک فلاسک حل و براي پنج دقيقه در دماي اطاق نگهداري شد. پس از آن رقت هاي مختلف 10به توان منفي 1 تا 10به توان منفي 4 تهيه و روي پليت ها روي محيط هاي KBC ,KB کشت شدند.

نتايج

1- تعيين علف هاي هرز ميزبان باکتري

از علف هاي هرز يک ساله نظير دم روباهي، ماشک، جوموشي (Hordeum murimum)، يولاف وحشي و همچنين علف هرز دائمي مرغ (Cynodon dectylon)، يک باکتري ميله اي شکل گرم منفي اکسيداز منفي و هوازي اجباري جداسازي و با استفاده از آزمون هاي LOPAT و ديگر ويژگي هاي بيوشيميايي به عنوان Pss شناسايي و بيماري زايي آن روي گندم با ايجاد لکه هاي نکتروتيک به اثبات رسيد.

2- تعيين بذرزاد بودن باکتري عامل سوختگي برگ گندم

200 بذر ضد عفوني شده از ارقام تجن، کراس آزادي و قدس در روش مستقيم به ترتيب در محيط نيمه انتخابي KBC، 8، 5 و 2 درصد کلني هاي فلورسنت را تشکيل دادند (جدول 1) ولي در روش شستشوي سطحي روي هيچ کدام از دو محيط کشت KBC , KB باکتري فلورسنت کننده جداسازي نگرديد. در روش عصاره گيري بذور از 500 بذر آزمايش شده، باکتري فلورسنت، در رقت 10به توان منفي1، حداکثر5/4×10به توان 3 CFU عدد در رقم تجن و CFU 2/6×10 به توان 3 به ترتيب در ارقام تجن و کراس آزادي روي محيط کشت KBC پيدا شد و کمترين کلني مربوط به رقم قدس که از مزارع کشاورزان به صورت تصادفي جمع آوري شده بود روي محيط کشت KB بدست آمد (جدول 2).
از بذور مذکور دو گروه باکتري فلورسنت کننده روي محيط هاي کشت مذکور جداسازي و شناسائي گرديد که يک گروه آن باکتري هاي گرم منفي ميله اي شکل هوازي اجباري از لحاظ ايجاد واکنش فوق حساسيت توليد لوان و لهانيدن ورقه هاي سيب زميني منفي و اکسيداز و آرجي نين مثبت و روي گندم بيماري زا نبودند. در حالي که در گروه دوم شامل باکتري هاي گرم منفي ميله اي شکل با چند تاژک قطبي، هوازي اجباري، اکسيداز و آرجي نين لهانيدن ورقه هاي سيب زميني، منفي، از لحاظ ايجاد واکنش فوق حساسيت توليد لوان مثبت و روي گندم بيماري زا بودند. ويژگي هاي ديگر اين دو گروه در جدول 4 آمده است. بر پايه اين نتايج گروه B Pseudomonas fluorescens(pf و گروه A Pss شناسايي شد.

بحث و نتيجه گيري

Pss قادر است که روي علف هاي هرز يک ساله شامل دم روباهي، ماشک، يولاف و حشي و جوموشي به حالت اپي فيت زندگي کند که در تحقيقات ديگر اثبات شده است. علاوه بر اين از علف هرز فرفيون (Euphorbia pulcherrima) به عنوان ديگر ميزبان اپي فيت اين باکتري ياد شده است. ولي در اين تحقيق اين علف هرز چندين بار از داخل و حاشيه مزارع گندم جمع آوري ولي Pss از آن جدا نگرديد. اين باکتري همچنين قادر است روي علف هرز دائمي مرغ (Cynodon doctylon) به صورت اپي فيت زندگي نمايد که در چندين منطقه از جمله سعادت شهر، مرودشت، ياسوج و اردکان جداسازي و بيماري زايي آن به اثبات رسيد. اين اولين گزارش در مورد مرغ به عنوان ميزبان اين باکتري مي باشد که بايستي در مديريت کنترل اين باکتري مبارزه با اين علف هرز مدنظر قرار داد. از بذور ارقام تجن، کراس آزادي و قدس دو باکتري مختلف روي محيط کشت هاي KBC , KB جداسازي و شناسايي گرديد و بر اساس آزمون هاي LOPAT و ساير تست هاي بيوشيميايي و بيماري زايي که روي آنها انجام گرفت نهايتاً جدايه B به عنوان يک باکتري pf و ساپروفيت شناسايي شد. در حاليکه جدايه A بيماري زا روي گندم به عنوان Pss شناسايي گرديد. بدين ترتيب باکتري اخير در گندم ممکن است بذرزاد باشد. Pss در روش شستشوي سطحي روي هيچکدام از دو محيط کشت KB , KBC جداسازي نگرديد. اين نتيجه مي تواند مؤيد اين موضوع باشد که باکتري Pss به صورت اندوفيت درون بذور گندم بسر مي برد و اين نتايج با يافته هاي رشيد، که اعلام نمود به احتمال زياد اين باکتري در بذر به صورت اندوفيت زندگي مي کند مطابقت دارد. در روش هاي مورد بررسي جهت تعيين ميزان بذرزاد بودن باکتري، از بوته هاي مايه زني شده ارقام تجن، کراس آزادي در گلخانه و رقم قدس که از مزارع کشاورزان جمع آوري شده بود استفاده شد. بيشترين آلودگي بذري روي محيط کشت KBC در روش مستقيم و کمترين آلودگي بذري روي رقم قدس که از مزارع کشاورزان جمع آوري شده بود، روي محيط کشت KB بدست آمد. دامنه بذر زاد بودن اين باکتري 6/5-0/5 درصد برآورد گرديد. در حالي که در ساير منابع ميزان بذرزاد بودن اين باکتري را تا 14 درصد نيز ذکر کرده اند و اين مي تواند به دليل حساسيت ارقام، شرايط آب و هوايي و محدوده جغرافيايي باشد. استفاده از بذور عاري از Pss، منوط به شناسايي باکتري بيماري زا در بذرهاي خالص شده است. ارزيابي نمونه ها نشان مي دهد که هيچگونه علائم ظاهري ناشي از باکتري فوق روي بذور گندم مشاهده نمي شود و جهت تعيين بذرزاد بودن باکتري بايستي از محيط کشت نيمه انتخابي KBC استفاده نمود. تعداد کمي از باکتريهاي ساپروفيت در اين محيط نيمه انتخابي قادر به رشد مي باشند و به آساني مي توان باکتري Pss را بر پايه مرفولوژي، رنگ کلني و آزمون اکسيداز در اين محيط کشت شناسايي نمود. تشخيص اين باکتري روي محيط کشت KBC نسبتاً ارزان و اجراي آن آسان و قابل تعميم به ساير ميزبان هاي اين باکتري از جمله جو، ذرت، لوبيا، گوجه فرنگي و سويا مي باشد. اين روش براي کشورهايي مانند ايران که منابع اقتصادي محدودي براي کنترل بذور دارند، قابل توصيه است.

منابع

1. افيون م. و. صحراگرد ن. 1374. بروز بلايت برگي گندم در شهرکرد. خلاصه مقالات دوازدهمين کنگره گياهپزشکي ايران، آموزشکده کشاورزي کرج، ص 28.
2. حسن زاده ن. 1374. اصول و روش هاي باکتري شناسي گياهي . مرکز انتشارت علمي دانشگاه آزاد اسلامي، 641 صفحه.
3. رحيميان ح. 1368. وقوع بيماري بلايت باکتريائي گندم در کرمان. خلاصه مقالات نهمين کنگره گياهپزشکي ايران، دانشکده کشاورزي، دانشگاه فردوسي مشهد، ص 146.
4. صحراگرد ن.، ض. بني هاشمي، و س. م. تقوي. 1377. گزارش بلايت باکتريائي گندم در استان فارس. مجله بيماري هاي گياهي، جلد 34 ص 121.

منبع:پژوهش در علوم کشاورزی
/س