روش های انتقال ژن های خارجی به گیاهان

توالی یابی ژنومی چندین ارگانیسم منجر به پیشرفت سریع مطالعات ژنومی شده است. انتقال ژن یک ابزار قدرتمند و یک تکنیک مهم برای مطالعه ژنومیک عملکردی گیاه، کشف ژن، بینش جدید در مورد عملکرد ژن و بررسی ویژگی های کنترل شده ژنتیکی است. علاوه بر این، عملکرد ژن‌های جدا شده با استفاده از شبیه‌سازی مبتنی بر نقشه آلل‌های جهش یافته با تکمیل عملکردی با استفاده از انتقال ژن تأیید شده است. علاوه بر این، امکان معرفی ژن های خارجی به گیاهان زراعی را فراهم می کند و به سرعت موجودات اصلاح شده ژنتیکی جدیدی را ایجاد می نماید. انتقال ژن ژن و مهندسی ژنتیک به افزایش کلی در بهره وری محصول کمک می کند. در اینجا روش‌های کلی برای انتقال ژن گیاه تشریح شده است و بر توسعه سیستم انتقال ژن آرابیدوپسیس تمرکز دارد.
 

روش های انتقال ژن به گیاه

انتقال ژن گیاه برای اولین بار در سال 1984 در تنباکو توصیف شد. از آن زمان، پیشرفت های سریع در فناوری انتقال ژن منجر به اصلاح ژنتیکی بسیاری از گونه های گیاهی شده است. روش‌های معرفی ژن‌های متنوع به سلول‌های گیاهی شامل انتقال ژن با واسطه Agrobacterium tumefaciens ،انتقال ژن به پروتوپلاست و بمباران ذره ای است. چندین تکنیک انتقال ژن از جذب DNA به پروتوپلاست های جدا شده با واسطه روش های شیمیایی، الکتروپوراسیون یا استفاده از ذرات با سرعت بالا (بمباران ذرات) استفاده می کنند. جذب مستقیم DNA هم برای انتقال دائمی ژن و هم برای بیان موقت ژن مفید است. با این حال، کارایی و بازده انتقال ژن به صورت دائمی پایین است و زمان زیادی طول می کشد تا گیاهان تراریخته کامل دوباره تولید شوند.

روش های شیمیایی

پروتوپلاست‌های گیاهی که با پلی اتیلن گلیکول تیمار شده‌اند، DNA را از محیط اطراف خود می‌گیرند و این DNA را می‌توان به‌طور پایدار در DNA کروموزومی گیاه ادغام نمود. سپس پروتوپلاست‌ها تحت شرایطی کشت می‌شوند که به آن ها اجازه می‌دهد دیواره‌های سلولی رشد کنند، شروع به تقسیم برای تشکیل پینه، رشد شاخه‌ها، ریشه‌ها و بازسازی گیاهان کامل کنند.
 

الکتروپوریشن

برای الکتروپوراسیون سلول های گیاهی به طور کلی از پروتوپلاست (سلول گیاهی بدون دیواره سلولی) استفاده می شود زیرا دیواره های سلولی گیاهی ضخیم بوده و حرکت ماکرومولکول ها را محدود می کند. پالس های الکتریکی به سوسپانسیون پروتوپلاست ها با DNA که بین الکترودها در یک کووت الکتروپوراسیون قرار می گیرد، اعمال می شود. پالس های الکتریکی با ولتاژ بالادر مدت زمان کوتاه اعمال می شود که باعث تشکیل ریز منفذهای موقت در غشای سلولی می شود که به DNA اجازه می دهد وارد سلول و سپس هسته شود. بعد از قطع پالس الکتریکی غشا مجدد به حالت اولیه برگشته و منافذ ایجاد شده درون آن از بین می رود.
 

 بمباران ذرات (ریزپرتابه)

بمباران ذرات تکنیکی است که برای وارد کردن DNA خارجی به سلول های گیاهی استفاده می شود. ذرات طلا یا تنگستن (1 تا 2 میکرومتر) با DNA پوشانده می شوند تا برای انتقال ژن استفاده شوند. ذرات پوشش داده شده در یک تفنگ ژنی بارگذاری می شوند و با انرژی الکترواستاتیک آزاد شده از یک قطره آب در معرض ولتاژ بالا یا با استفاده از گاز هلیوم تحت فشار به سرعت بالا می رسند. هدف این بمباران ذره ای می تواند سوسپانسیون های سلولی گیاهی، کشت کالوس یا بافت باشد. پرتابه ها به دیواره ها و غشاهای سلولی گیاه نفوذ می کنند. هنگامی که ریزپرتابه ها وارد سلول ها می شوند، سازه های ژنی که همراه خود حمل کرده بودند از سطح ذرات برای ادغام بعدی در DNA کروموزومی گیاه آزاد می شوند.
 

 

استفاده از آگروباکتریوم برای انتقال ژن به گیاه

انتقال ژن با واسطه آگروباکتریوم متداول ترین روش مورد استفاده برای مهندسی ژنتیک گیاهی است. باکتری پاتوژن خاک Agrobacterium tumefaciens که باعث بیماری گال طوقه گیاه می شود، این توانایی را دارد که بخشی از DNA پلاسمید خود (به نام DNA انتقال یا T-DNA) را به ژنوم هسته سلول های گیاهی آلوده وارد کند. Arabidopsis thaliana، یک گیاه گلدار کوچک و یک ارگانیسم مدل است که به طور گسترده در زیست شناسی مولکولی گیاهان استفاده می شود. اولین مورد در انتقال ژن گیاه آرابیدوپسیس شامل استفاده از کشت بافت و بازسازی گیاه بود. خلاء آگروباکتریوم و غوطه وری گل روش های کارآمدی برای تولید گیاهان تراریخته هستند. آن ها امکان انتقال ژن گیاه را بدون نیاز به کشت بافت فراهم می کنند. روش غوطه وری گل به طور قابل توجهی سهولت ایجاد Arabidopsis های تراریخته را افزایش داده است و این روش پرکاربردترین روش انتقال ژن است. این روش‌ها بعداً ساده‌تر و به طور قابل ملاحظه‌ای بهبود یافتند و به طور قابل‌توجهی کار، هزینه و زمان مورد نیاز را در مقایسه با روش‌های قبلی کاهش دادند. با این حال، این روش های انتقال ژن مشکلاتی دارند. روش غوطه وری گل شامل غوطه ور کردن جوانه های گل آرابیدوپسیس در سوسپانسیون سلولی آگروباکتریوم است که نیاز به حجم زیادی از کشت باکتری رشد یافته در محیط های مایع دارد. بنابراین نیاز به شیکر ها و سانتریفیوژهای بزرگ و فضای آزمایشی کافی دارند. این عوامل کمیت های انتقال ژن را محدود می کنند. در اینجا، ما یک روش بهبود یافته را برای انتقال ژن با واسطه Agrobacterium توصیف می کنیم که به حجم زیادی از کشت مایع لازم برای غوطه وری گل نیاز ندارد.
 


روش بهبود یافته برای انتقال ژن با واسطه Agrobacterium:  آرابیدوپسیس را می توان با استفاده از انتقال T-DNA توسط Agrobacterium tumefaciens با راندمان بالا به طور پایدار و دائمی انتقال ژن کرد. انتقال ژن با واسطه آگروباکتریوم با استفاده از روش غوطه وری گل پرکاربردترین روش برای انتقال ژن آرابیدوپسیس است. دانشمندان نشان داده اند که A. thaliana با تلقیح جوانه‌های گل با 5 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی آگروباکتریوم انتقال ژن می‌شود، بنابراین از استفاده از حجم زیادی از کشت آگروباکتریوم اجتناب می‌شود. با استفاده از این روش تلقیح گل، 15 تا 50 گیاه تراریخته در هر سه گیاه A. thaliana انتقال ژن شده به دست  آمده است. روش تلقیح گل می تواند به طور رضایت بخشی در تجزیه و تحلیل های بعدی استفاده شود. این روش ساده، بدون غوطه وری گل، انتقال ژنی به همان اندازه کارآمدی را ارائه می دهد که روش های قبلی گزارش شده است. این روش کار، هزینه، زمان و مکان کلی را کاهش می دهد. یکی دیگر از جنبه های مهم این روش اصلاح شده این است که اجازه می دهد بسیاری از انتقال ژن های مستقل به طور همزمان انجام شوند.
 

انتقال ژن به کمک نانوذرات

انتقال ژن با نانوذرات مغناطیسی

در سال‌های اخیر، تعدادی از ابزارهای فناوری نانو برای غلبه بر محدودیت‌های تکنیک‌های سنتی برای مهندسی ژنتیک گیاهی توسعه یافته‌اند. یکی از این روش‌های نوظهور، استفاده از نانوذرات اکسید آهن مغناطیسی است که با DNA ترکیب شده‌اند. این روش به طور گسترده برای انتقال سلولی پستانداران استفاده شده است، اما به دلیل وجود دیواره سلولی گیاهی که بر خلاف غشای سلولی، دچار اندوسیتوز نمی شود، سازگاری آن برای مهندسی گیاه چالش برانگیز است. ابتدا آکادمی علوم کشاورزی چین نشان داد که روزنه‌های گرده‌های پنبه دیواره سلولی ندارند و سپس از نانوذرات مغناطیسی به عنوان حامل برای انتقال ژن‌ها از طریق این روزنه‌های بدون دیواره سلولی استفاده کردند. آن ها دریافتند که روش مغناطیسی آن ها بیش از 80 درصد قابلیت زنده ماندن در گرده ها را فراهم می کند. این تیم با استفاده از تصویربرداری فلورسانس کانفوکال و طیف‌سنجی پراکنده انرژی، تأیید کرد که حامل‌های ژن نانوذرات با برچسب فلورسنت به گرده‌ها تحویل داده شده‌اند. در نهایت، با استفاده از PCR، تیم نشان داد که آن ها قادر به ادغام ژن BTΔα-CPTI در ژنوم گیاه پنبه تراریخته برای ایجاد مقاومت در برابر حشرات، با وراثت پایدار در فرزندان هستند. این تیم همچنین گزارش داد که روش مغناطیسی آن ها برای سایر گونه های گیاهی از جمله کدو تنبل و زنبق کار می کند. علیرغم نتایج امیدوارکننده این تیم، ممکن است هنوز زود باشد که نتیجه گیری کنیم که نانوذرات مغناطیسی برای انتقال ژن در گونه های مختلف گیاهی موثر است. در مقاله‌ای اخیر، تیمی به رهبری جان فاولر (استاد دانشگاه ایالتی اورگان)، بیش از 50000 دانه گرده را غربال کردند و گزارش کردند که میدان مغناطیسی با استفاده از نانوذرات مغناطیسی به خوبی برای گونه‌های گیاهی تک لپه‌ای مانند سوسن که توسط آکادمی چین ادعا می‌شود، کار نمی‌کند. نویسندگان همچنین استدلال کردند که راندمان انتقال 90% در گرده زنبق که توسط آکادمی چین گزارش شده است، احتمالاً به دلیل استفاده نادرست از نشانگر زیستی، β-گلوکورونیداز، برای نشان دادن موفقیت ترانسفکشن است، زیرا β-گلوکورونیداز به صورت درون زا در گیاه نیز وجود دارد.
 

انتقال ژن به گیاه با واسطه نانولوله های کربنی

علاوه بر استفاده از نانوذرات مغناطیسی، نانولوله‌های کربنی نیز یک نانوابزار محبوب برای انتقال گیاهان هستند. مارکیتا لاندری ( استاد، و تیم او در دانشگاه کالیفرنیا، برکلی)، استفاده از نانولوله‌های کربنی را گزارش کردند که بر تحویل غیرفعال به عنوان ابزار تبدیل گیاه متکی هستند. به عنوان یک اثبات مفهوم، تیم او DNA رمزگذاری شده برای پروتئین فلورسنت سبز (GFP) را بر روی نانولوله های کربنی تک جداره به صورت فیزیکی جذب و به صورت الکترواستاتیک پیوند زد و نشان داد که تکنیک آن ها می تواند به طور موثر DNA را به برگ های گونه های مختلف گیاهی منتقل کند. گندم، پنبه و آرگولا برای بیانموقت ژن بررسی شدند. نانولوله ها همچنین برای محافظت از DNA در برابر تخریب توسط نوکلئازهای درون سلولی گیاه مفید هستند لندری و تیم او همچنین نشان دادند که فناوری نانولوله کربنی آن ها با انجام تجزیه و تحلیل کمی PCR از NbrbohB، یک ژن استرس شناخته شده در گیاهان تنباکو، و نسبت به ژن خانه داری، منجر به سمیت قابل توجهی در برگ های بالغ نمی شود. برای نشان دادن بیشتر سودمندی روش خود، این تیم همچنین فناوری نانولوله خود را روی پروتوپلاست‌هایی آزمایش کردند که به طور گسترده در بیوتکنولوژی برای نمایش‌های ژنتیکی گیاهی و سنتز پروتئین‌های نوترکیب استفاده می‌شوند. پروتوپلاست های جدا شده از برگ های آروگولا توانستند نانولوله های کربنی را درونی کنند و پلاسمید GFP را با 80 درصد به طور پایدار و دائمی بیان کردند.  siRNA یک RNA مفید برای مهندسی ژنتیک گیاهان به صورت موقت است. با استفاده از نانولوله‌های کربنی تک جداره، لندری و تیمش با موفقیت انتقال siRNA را برای مهار و خاموش کردن بیان GFP در برگ‌های گیاه تنباکو تا یک هفته نشان دادند.
 

استفاده از روش انتقال ژن با نانوذرات در گیاهان

تاثیر استفاده از نانوذرات برای مهندسی ژنتیک گیاهی این است که تحویل DNA و RNA را می توان بدون پاتوژن هایی مانند آگروباکتریوم یا بدون استفاده از نیروی بیولیستیک که بافت گیاه را مختل می کند، انجام داد. مزیت دیگر این است که تحویل نانوذرات siRNA می تواند جایگزین سبز برای استفاده از آفت کش های شیمیایی یا تحویل mRNA برای دستکاری ژنتیکی بدون DNA در گیاهان باشد. لاندری می‌گوید به طور کلی، نانوذرات می‌توانند کارایی انتقال ژن، دقت و سهولت مهندسی ژنتیک گیاهی را افزایش دهند.
 

مشکلات حل نشده

نانوتکنولوژی به طور قابل توجهی برنامه‌ریزی مجدد ژنتیکی سلول‌های پستانداران را افزایش داده است و ابزار امیدوارکننده‌ای برای مهندسی گیاهان نیز می‌باشد. با این وجود، برای پیشبرد این حوزه، باید به چندین سوال مهم پرداخت.
 
اول، برخلاف سلول‌های پستانداران، سلول‌های گیاهی دارای دیواره‌های سلولی سفت و سختی هستند که ذرات بزرگ‌تر از تقریباً 5 تا 20 نانومتر را حذف می‌کند و شواهد بررسی‌شده کافی برای حمایت از اینکه نانوذرات قادر به انتشار از طریق دیواره سلولی چند لایه و سپس سلول هستند، وجود ندارد. بنابراین، در مورد اینکه چگونه خواص نانوذرات بر تعامل آن ها با سلول‌ها و بافت‌های گیاهی تأثیر می‌گذارد برای درک مکانیکی فرایند انتقال نانوذرات از طریق دیواره و غشای سلولی بسیار مهم است. برای مثال، تیمی به رهبری مایکل استرانو( پروفسور مؤسسه فناوری ماساچوست)، دریافتند که انتقال کربن تک جداره نانولوله‌های غشای سلولی گرده عمدتاً توسط پتانسیل زتا سطحی کنترل می‌شوند. تفاوت‌های بیولوژیکی پیچیده بین گونه‌های گیاهی و انواع مواد بیولوژیکی از گیاهان (پروتوپلاست‌ها، برگ‌ها، گرده‌ها و بافت‌های قابل بازسازی مانند ریشه های مویین) نیز به این معنی است که خصوصیات سیستماتیک گیاه - برهمکنش‌های نانوذرات برای افزایش نتایج ترانسفکشن مورد نیاز است.
 
دوم، اندازه محموله DNA که می تواند به سلول های گیاهی تحویل داده شود، به طور مستقیم با سطح نانوذرات در ارتباط است. تاکنون، بیشتر نانوذرات کروی کوچک (کمتر از 20 نانومتر) و نانولوله‌های کربنی استوانه‌ای تک جداره (قطر 0.8 تا 1.2 نانومتر و طول 500 تا 1000 نانومتر) برای انتقال سلول‌های گیاهی از طریق انتشار غیرفعال و/یا به کمک نیروهای مکانیکی مانند تفنگ ژنی مفید بوده‌اند. متأسفانه، این بدان معناست که تنها بار ژنی کوچک (~4 کیلوبیت بر ثانیه) با ارزش فیزیولوژیکی، اقتصادی و کشاورزی محدود قابل حمل و انتقال به گیاه است.
 
سوم، نشان داده شده است که نانوذرات مانند نانولوله‌های کربنی می‌توانند به طور نامطلوبی از کشیدگی ریشه محصولات مهمی مانند گوجه‌فرنگی و کاهو جلوگیری کنند، اما هنوز مشخصه سمیت سلولی کافی در متون وجود ندارد که آیا گیاهان مهندسی شده پس از انتقال نانوذرات به رشد سالم خود ادامه می دهند تا بتوانند به عنوان منابع گیاهی جدید مورد استفاده بشر قرار گیرند. در نهایت، بیشتر تکنیک‌های نانوتکنولوژی برای انتقال به گیاه، بیان موقت ژن را ارائه می‌دهند. در حالیکه برای مهندسی محصولات زراعی که در آن بیان دائمی و دراز مدت ژن برای ارائه فنوتیپ های پایدار مورد نیاز است. مهندسی ژنتیک گیاهی به دلیل رشد جمعیت و افزایش تقاضا برای غذا، دارو و مواد اهمیت فزاینده ای پیدا خواهد نمود. همکاری‌های بیشتر بین نانوتکنولوژیست‌ها و زیست‌شناسان گیاهی به گسترش جعبه ابزار انتقال ژن به گیاهان موجود با استفاده از فناوری نانو برای ایجاد تأثیر اجتماعی مثبت کمک می‌کند.

منبع:  
یوشیرو ناروساکا؛ Research Institute for Biological Sciences, OKAYAMA و Genetic Engineering and Biotechnology News