توالی یابی نسل جدید (NGS)، روش توالی یابی جدید برای توالی یابی DNA و RNA هستند. محققان از NGS در تحقیقات پایه، کاربردی و بالینی استفاده می کنند. در سال 1970، اولین توالی یابی DNA به نام توالی یابی سنگر یا توالی یابی DNA اصلی توسط فردریک سنگر و همکاران توسعه یافت. توالی یابی DNA سنگر امکان تجزیه و تحلیل ژن های منفرد یا بخش هایی از آن را فراهم کرد. برای سه دهه، توالی یابی سنگر به طور گسترده توسط زیست شناسان مورد استفاده قرار گرفت. بعداً، ظهور NGS رخ داد که فرصت‌ها و چالش‌های جدیدی را برای زیست‌شناسان و پزشکان در زمینه اکتشاف ژنوم و تشخیص بالینی ایجاد کرد. NGS دارای چندین مزیت نسبت به توالی سنگر است. NGS می‌تواند داده‌های موازی و با توان بالا را از نمونه‌های متعدد در هر اجرا با هزینه کاهش قابل توجهی در مقایسه با سنگر ارائه دهد. علاوه بر این، NGS داده های توالی یابی دقیق و قابل اطمینان تری را نسبت به توالی یابی سنگرارائه می دهد. توالی یابی ژنوم انسان تقریباً در 13 سال با استفاده از توالی یابی سنگر با هزینه ای بیش از یک میلیون دلار انجام شد، در حالیکه اکنون می توان ژنوم انسان را در عرض یک هفته با هزینه 100 دلار آمریکا تعیین توالی نمود. با توجه به این مزایا، NGS به ابزاری قدرتمند و ارزشمند برای تحقیقات و کاربردهای بالینی تبدیل شده است. پیشرفت‌ها در فناوری‌های NGS و بیوانفورماتیک، فرصت‌هایی را برای محققان ایجاد کرده است تا توالی‌یابی کل ژنوم را انجام دهند. علاوه بر این، داده‌های تولید شده از طریق فناوری‌های توالی‌یابی، محققان را برای انجام تجزیه و تحلیل عمیق خانواده ژنی که می‌تواند به ما در درک تاریخچه تکاملی خانواده‌های ژنی کمک کند، تشویق می‌کند.

کاربردهای بالینی NGS

از آنجایی که فناوری‌های NGS قادر به توالی یابی از اهداف در مقیاس بزرگ هستند، فهرست کاربردهای سنجش‌های مبتنی بر NGS در حال گسترش است. داده‌های ژنتیکی به‌دست‌آمده توسط NGS با شناسایی دقیق نشانگرهای زیستی بیماری، کشف اختلالات مادرزادی، و شناسایی عوامل ژنتیکی که می‌توانند برای پیش‌بینی پاسخ‌ها به درمان‌ها راهنمایی کنند، به اقدامات بالینی کمک می‌کند. در زمینه زیست پزشکی، برای ارزیابی پیشرفت بیماری و برای پیش‌بینی پاسخ درمانی یا بقای بیمار، ژن‌ها و پروتئین‌های نمونه بافت بیمار به‌عنوان نشانگرهای زیستی با کمک NGS مشخص می‌شوند. در ادامه، کاربردهای بالینی رایج فناوری NGS را در شرح خواهیم داد.

انکولوژی

یکی از بزرگترین دغدغه های جامعه بشری، درمان موثر سرطان است. درک عمیق از پاتوژنز سرطان برای توسعه روش های درمانی جدید ضروری است. سرطان معمولاً تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی است که در یک یا گروهی از سلول‌ها رخ می‌دهد و منجر به گسترش کلونال و رشد کنترل‌نشده می‌شود. تغییرات ژنومی مانند جهش‌های نقطه‌ای، درج‌ها، حذف‌ها، تغییرات تعداد کپی و SV ها باعث ایجاد سرطان می‌شوند و این تغییرات ژنومی می‌توانند سوماتیک یا ارثی باشند. بنابراین، تجزیه و تحلیل های مبتنی بر NGS از سلول ها و ساختارهای سرطانی فرصت های بی پایانی را برای درک پاتوژنز، تشخیص، مدیریت، درمان بیماری و توسعه استراتژی های درمانی شخصی فراهم می کند. با کمک داده های ژنومی و توالی یابی کامل اگزونی ((WES، جهش های جدید مختلف مرتبط با و سرطان سینه شناسایی شدند. اولین تست مبتنی بر WES توسط وزارت بهداشت ایالت نیویورک به نام EXaCT-1 (تست سرطان Exome) در سال 2015 مورد تایید قرار گرفت. در سال‌های اخیر، NGS بالینی با بیش از 250 آزمایشگاه تأیید شده اصلاحیه‌های آزمایشگاهی بالینی دانشگاهی و تجاری (CLIA) که آزمایش‌های مبتنی بر NGS نمونه‌های زیستی انکولوژی را ارائه می‌دهند، افزایش سریعی را تجربه کرده است. اکثر آزمایشگاه های بالینی به طور گسترده از پانل های ژنی هدفمند برای تحقیقات (مانند ن‌های BRCA1 و BRCA2 مرتبط با سرطان سینه و تخمدان) استفاده می کنند. آزمایش‌های مبتنی بر NGS همچنین در ایجاد طبقه‌بندی‌های جدید بیماری‌های مولکولی از نظر جهش‌های محرک سرطان و حساسیت دارویی مفید هستند که ممکن است در تصمیم‌گیری بالینی و مراقبت از بیمار مفید باشند. علاوه بر این، آزمایش‌های فارماکوژنومیک اخیراً محبوبیت پیدا کرده‌اند که در آن وضعیت جهش ژن‌های منتخب در بیماران مشخص می‌شود، بنابراین می‌توان درمان هدفمند مولکولی را همراه با تعیین حساسیت به سمیت دارویی، ارزیابی پیش آگهی و پیش‌بینی مقاومت انجام داد.

اختلالات هماتولوژیک

پیشرفت قابل توجهی در کاربردهای NGS برای هماتولوژی خوش خیم و بدخیم انجام شده است. رویکردهایی مانند WES، پانل ژنی هدفمند و NGS برای تشخیص بیماری‌های هماتولوژیک از انواع اختلالات گلبول قرمز، اختلالات خونریزی و اختلالات نقص ایمنی اولیه استفاده شده‌اند. توالی‌یابی هدفمند اگزوم قبلاً برای تشخیص سندرم‌های بالینی مانند کم‌خونی فانکونی (FA)، سندرم‌های عصبی آکانتوسیتوز (NA) و کم‌خونی دیاموند (DBA) استفاده شده است. توالی یابی اگزوم در بیماران FA تعدادی جهش را در ژن های مرتبط با FA شناسایی کرده است که بسیاری از آنها جدید بودند. در سندرم های NA، هر دودمان خانواده دارای جهش های منحصر به فردی است که تشخیص جهش را دشوار می کند. همچنین، بسیاری از ژن های NA بسیار بزرگ هستند و توالی یابی سنتی سنگر را غیرقابل استفاده می کند. استفاده از توالی یابی اگزوم به شناسایی جهش های هتروزیگوت ترکیبی ژن VPS13A در دو بیمار NA کمک کرد که امکان تشخیص دقیق ژنتیکی را فراهم نمود. به طور مشابه، WES هدفمند برای مطالعه ژن های پروتئین های ریبوزومی در بیماران DBA، شناسایی جهش در 15 بیمار از 17 بیمار مورد استفاده قرار گرفته است. در چند سال گذشته، توالی یابی نانوحفره (ONT) فرصت های گسترده ای را در زمینه بیماری های خونی فراهم کرده است و برای ارزیابی وضعیت جهش ژن های منفرد یا چندگانه درگیر در یک بیماری خاص به طور گسترده مورد استفاده قرار گرفته است.

قلب و عروق

امروزه امکان انجام WGS (توالی یابی کامل ژنوم) و WES (توالی یابی کامل اگزونی) برای تشخیص تغییرات در بیماران مبتلا به بیماری‌های ژنتیکی نادر و همچنین اختلالات پیچیده مانند بیماری‌های قلبی عروقی رایج (CVD) وجود دارد. هم در اختلالات مندلی سیستم قلبی عروقی و هم در CVD های ژنتیکی پیچیده، کاربردهای بالینی دارد. اختلالات مندلی در پزشکی قلبی عروقی شامل کاردیومیوپاتی های هیپرتروفیک، هیپرکلسترولمی خانوادگی و کانالوپاتی است، در حالیکه شایع ترین CVD ها شامل سکته مغزی و بیماری عروق کرونر (CAD) می شود. مشخص شده است که جهش در تقریبا 30 ژن مختلف مسئول اشکال ارثی کاردیومیوپاتی است. بنابراین، انجام آزمایش‌های ژنتیکی خاص در بیماران مبتلا به کاردیومیوپاتی بسیار مهم است. برای شناسایی کامل واریانت‌های ژن‌های دخیل در کاردیومیوپاتی، یک توالی‌یابی هدفمند با NGS پیشنهاد شده است. آزمایشات ژنتیکی به دلیل نقش انحصاری تکنیک های NGS در تشخیص جهش های مسبب برای شرایط اغلب کشنده و غربالگری اعضای خانواده که در حال حاضر در معرض خطر هستند، به تدریج فرآیند مدیریت بیماری را در مورد کانالوپاتی ها متحول می کند. یکی دیگر از کاربردهای آزمایش جامع ژنتیک، تعیین علت مرگ ناگهانی قلبی است. آزمایش ژنتیکی ژن‌های KCNQ1، KCNH2، SCN5A و RYR2 در نمونه‌های تهیه‌شده پس از مرگ نشان داد که کانالوپاتی‌های یونی علت تقریباً 35 درصد از سندرم مرگ ناگهانی آریتمی هستند. به طور مشابه، در مورد هیپرکلسترولمی خانوادگی، یک رویکرد تشخیص جامع شامل NGS هدفمند، آزمایش برای تغییرات در تعداد کپی و تعداد صفات چند ژنی می تواند در تشخیص بیشتر بیماران کمک کند. سایر علل عمده مرگ و میر، عوارض بیماری CAD و سکته مغزی هستند. بررسی بیان ژن توسط RNA-seq روشی موثر در تحقیقات قلبی عروقی است. چندین گزارش وجود دارد که نقش مهم miRNA ها را به عنوان نشانگرهای زیستی در CAD ها نشان می دهد. با کمک NGS، شناسایی miRNA های جدید و روشن کردن مکانیسم های مولکولی دخالت miRNA در بیماری های قلبی عروقی امکان پذیر شده است. علاوه بر این، نشانگرهای زیستی اپی ژنتیکی که شامل متیلاسیون DNA، تغییرات هیستون و مکانیسم‌های مبتنی بر RNA هستند اخیراً به عنوان نشانگرهای زیستی امیدوارکننده برای CVD ظاهر شده‌اند.

میکروبیولوژی بالینی

در میکروبیولوژی بالینی، فناوری‌های NGS برای مجموعه‌ای از کاربردها مانند شناسایی منشاء شیوع، ردیابی انتقال، بررسی همه‌گیری، مقاومت آنتی‌بیوتیکی و کشف پاتوژن‌های جدید انسانی مفید بوده است. NGS به طور گسترده برای تقریباً هر پاتوژنی مانند ویروس ها، باکتری ها، قارچ ها، انگل ها، ناقل های حیوانی و میزبان های انسانی قابل استفاده است. استفاده قابل توجه از WGS در اپیدمیولوژی بهداشت عمومی، شناسایی و ردیابی شیوع است. به عنوان مثال، WGS سویه‌های مختلف کروناویروس جدید در حال حاضر در سرتاسر جهان انجام می‌شود که به دانشمندان کمک می‌کند تا عملکرد ژن‌های دخیل در رشد، توسعه و نگهداری یک ارگانیسم را درک کنند. همچنین، مهمتر از آن، منشاء این ویروس را می توان از داده های توالی فهمید. WGS همچنین اطلاعات حیاتی در مورد نحوه ایجاد پاتوژن و تشخیص مکانیسم های جدید مقاومت را ارائه می دهد. از طرفی، NGS عمدتاً برای شناسایی پاتوژن ها و ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی در نمونه های بیمار استفاده می شود.

تشخیص بیماری های مادرزادی پیش از تولد

با پیشرفت فناوری NGS و کشف DNA عاری از سلول جنین (cfDNA) در پلاسمای مادر، انقلابی در زمینه تشخیص بیماری قبل از تولد رخ داده است. توسعه آزمایش‌های غربالگری بسیار حساس برای آنیوپلوئیدی‌های جنینی منجر به پیشرفت در دو حوزه اصلی شده است: تشخیص غیرتهاجمی پیش از تولد (NIPD) برای اختلالات تک ژنی و توالی اگزوم جنین. پیش از این، NIPD معمولاً برای اکثر آنوپلوئیدی‌های ژنتیکی مانند تریزومی 21، 13 و 18 استفاده می‌شد، اما اکنون تعدادی از بیماری‌ها را می‌توان پیش از تولد توسط NIPD تشخیص داد. علاوه بر این، NIPD تشخیص ایمن، دقیق و قطعی اختلالات تک ژنی را در اوایل بارداری فراهم می کند. یکی دیگر از رویکردهای موفقیت آمیز برای دستیابی به تشخیص های ژنتیکی، WES جنینی است که توانایی تشخیصی بسیار گسترده تری را برای جنین ها و اطلاعات پیش آگهی بهتری برای جنین های دارای ناهنجاری های تشخیص داده شده در سونوگرافی قبل از تولد ارائه می دهد. WES قبل از تولد می تواند بازده تشخیصی بین 6 تا 80 درصد را در جنین هایی با ناهنجاری های سونوگرافی تشخیص داده نشده ارائه دهد. WES پیش از تولد همچنین کشف ژن های کاندید جدید را تسهیل می کند. به عنوان مثال، KIF به عنوان علت دو اختلال ناهنجاری متعدد، یعنی سندرم هیدرولتالوس جنین و آکروکالوزال کشف شد. اخیراً، توسعه تجزیه و تحلیل cfDNA جنین با استفاده از ترانس کریپتوم و توالی متیلوم، مزایای بالینی را برای نظارت بر سایر آسیب‌شناسی‌های مرتبط با بارداری مانند پره اکلامپسی و محدودیت رشد داخل رحمی ارائه کرده است.

مغز و اعصاب

روش‌های NGS تشخیص‌های مولکولی نادر در بیماری‌های تخریب‌کننده عصبی مانند اسکیزوفرنی، صرع، بیماری پارکینسون (PD)، بیماری آلزایمر (AD)، اختلال دوقطبی و غیره را امکان‌پذیر می‌کنند و رژیم‌های درمانی مناسب را تسهیل می‌کنند. علل و عوامل مسئول شروع و تأثیر شرایط عصبی بر رفاه انسان را می توان با رویکردهای بین رشته ای از جمله تجزیه و تحلیل های مبتنی بر ژنومیک مانند NGS، GWAS و GCTA درک کرد. در حال حاضر، پانل های ژنی هدفمند موثرترین انتخاب برای بسیاری از بیماری های عصبی هستند. بارزترین نمونه از فناوری WGS، تشخیص یک جهش رمزگذاری شده در یک بیماری نادر نورودژنراتیو شارکو ماری دندان و به دنبال آن صرع زودرس و نوروپاتی حسی و حرکتی همراه با میکروسفالی بود. معمولاً جهش‌ها در توالی‌های کدکننده که بر توسعه ژن بیماری شناخته شده تأثیر می‌گذارند، به راحتی قابل تفسیر هستند. AD یک بیماری عصبی پیشرونده است که داروهای بالینی موجود برای درمان آن رضایت بخش نیستند، زیرا فقط علائم را بهبود می بخشند اما آن را درمان نمی کنند. بنابراین، مطالعات بیشتر برای استراتژی‌های درمانی مؤثر برای AD ضروری است. NGS استراتژی‌های توالی‌یابی سریع و مقرون‌به‌صرفه را برای توالی‌یابی یک ژنوم کامل ارائه می‌کند و تشخیص را در کوتاه‌ترین زمان ممکن تسهیل می‌کند. تقریباً 50 نوع غیر مترادف در ژن‌های عامل خطر AD با شروع دیررس توسط NGS شناسایی شده‌اند که نقش جهش‌ها در پاتوژنز AD را برجسته می‌کند. در PD که با معاینه عصبی قابل تشخیص است، 13 جایگاه و 9 ژن درگیر هستند. با این حال، هیچ آزمایشگاهی نمی تواند به وضوح این بیماری عصبی را تعریف کند. بنابراین می توان از NGS برای تعیین تأثیر ژن ها بر PD برای کشف ژن های مرتبط با بیماری استفاده کرد. به طور مشابه، در صرع، از NGS برای دسته بندی 977 ژن مرتبط با صرع استفاده شد.

چالش ها و محدودیت ها

اگرچه فناوری NGS برای استفاده در پس‌زمینه‌های بالینی شتاب بیشتری به دست آورده است، چالش‌ها همچنان پابرجا هستند. امروزه، طیف متنوعی از تست‌های تشخیصی مولکولی از فناوری NGS مانند WGS، WES، ترانسکریپتومیکس، اپی ژنتیک، متابولومیکس، تست‌های پانل هدفمند، DNA بدون سلول برای NIPD و غیره استفاده می‌کنند. چالش‌های عمده‌ای که با آن روبرو هستیم، تعیین دقیق ژن‌های هدف، شناسایی یک روش NGS مناسب برای پانل NGS، و اعتبارسنجی مناسب سنجش‌های مبتنی بر NGS انجام شده است. علاوه بر این، تفسیر و ابلاغ نتایج آزمایش به بیمار و خانواده باید با احتیاط انجام شود. عوامل چالش برانگیز همچنین شامل پوشش کافی و توالی 100٪ ژنوم برای تشخیص است. بنابراین، پوشش کامل ژن برای بهبود عملکرد تشخیصی آزمایش ژنتیک ضروری است. این وظیفه را می توان با رویکرد توالی موازی انبوه مورد بررسی قرار داد. همچنین، تشخیص های مبتنی بر ژنوم قادر به توالی یابی کل ژنوم نیستند (8 درصد ژنوم توالی یابی نشده است). توالی یابی کامل ژنوم برای آشکار کردن تغییرات اپی ژنتیک ضروری است. در سلامت باروری، تشخیص NGS برای غربالگری پیش از تولد نوزادان و قبل از لانه گزینی استفاده می شود. در حال حاضر، اکثر استفاده کنندگان از تست NGS زنانی هستند که در معرض خطر بالای حاملگی نوزادان با ناهنجاری های کروموزومی هستند. پتانسیل آینده بازار تأثیر عمده ای بر پذیرش یا عدم پذیرش غربالگری مبتنی بر NGS توسط جمعیت بیماران با خطر متوسط خواهد داشت. برای تسهیل این امر، ارائه دهندگان بیمه و پرداخت کنندگان جایگزین باید مزایای بالینی غربالگری این بخش از افراد را درک و شناسایی کنند. به طور مشابه، NGS یک بازار بالقوه قوی در آینده در اختلالات قلبی-عروقی و عصبی دارد. علیرغم ارزش اثبات شده فن آوری های NGS در تحقیقات سرطان، کاربرد آنها در شیوه های بالینی و معمول آزمایشگاهی هنوز در مراحل اولیه است. دو دلیل اصلی برای استفاده محدود از فناوری های NGS در پس زمینه های بالینی وجود دارد. اولین مشکل بازپرداخت است. ارائه دهندگان بیمه به شدت روی آن دسته از آزمایشات بالینی متمرکز هستند که اطلاعاتی را ارائه می دهند که مستقیماً بر مراقبت از بیمار تأثیر می گذارد. در غیر این صورت هزینه آزمون مسترد نخواهد شد. مشکل دوم مربوط به مسائل نظارتی است. دانش خصوصیات ژنتیکی فردی توسط پزشکی شخصی برای تعیین درمان هدفمند مورد نیاز است. اغلب اوقات، درمان شخصی مستلزم آگاهی از کل اگزوم و رونوشت بیمار است. با این حال، هنوز هیچ تست تشخیصی مبتنی بر NGS مورد تایید FDA برای این منظور وجود ندارد. بنابراین، برای پر کردن شکاف بین پیشرفت‌های NGS و کاربردهای بالینی آن، پیشرفت مداوم در فناوری‌های توالی‌یابی و الگوریتم‌های تحلیلی مورد نیاز است.

منبع: سندی ورما، National Institute of Plant Genome Research