مهندسی ژن‌ها

به هنگام صحبت از مهندسی ژنتیک معمولاً جنبه‌ای از آن بیش‌تر مورد توجه قرار می‌گیرد که ناظر به ثمراتی است که این فناوریِ نسبتاً جدید به بشر عرضه داشته است و هم‌چنان در حال عرضه است. از‌جمله‌ی ثمرات بی‌شمار این فن
سه‌شنبه، 27 فروردين 1392
تخمین زمان مطالعه:
موارد بیشتر برای شما
مهندسی ژن‌ها
مهندسی ژن‌ها

 

تألیف و ترجمه: حمید وثیق زاده انصاری
منبع:راسخون



 
به هنگام صحبت از مهندسی ژنتیک معمولاً جنبه‌ای از آن بیش‌تر مورد توجه قرار می‌گیرد که ناظر به ثمراتی است که این فناوریِ نسبتاً جدید به بشر عرضه داشته است و هم‌چنان در حال عرضه است. از‌جمله‌ی ثمرات بی‌شمار این فن عبارت است از تولید دام‌های پرگوشت، غلات مقاوم در‌برابر آفات، و باکتری‌هایی که از آن‌ها برای ساختن هورمون‌های انسانی استفاده می‌شود. این‌ها و امثال این‌ها از جمله نتایج بی‌شمار توانایی انسان امروز در تغییر ژن‌های یک جان‌دار یا انتقال آن‌ها به جان‌داری دیگر است. جا به جایی یک ژن به معنای برداشتن قسمتی از یک مولکول دی ان اِی و قرار دان آن در محلی مشخص از مولکولی دیگر است. اما به‌راستی مهندسین ژنتیک چگونه به چنین جراحی‌های مولکولی موفق می‌شوند؟ برای این‌که دریابیم که چگونه می‌توان در دی ان اِی دست‌کاری کرد لازم است قبلاً درک واضحی از این مولکول‌های زیستی داشته باشیم. مولکول‌های دی ان اِی یا اسید دزوکسی ریبو نوکلئیک (DNA) مولکول‌های بزرگی از جنس اسید نوکلئیک هستند که در آن‌ها کلیه‌ی اطلاعات ژنتیک ضروری جهت تنظیم رشد و نمو و سوخت و‌ساز و حتی اطلاعات مربوط به ساختار یاخته‌ها قرار داده شده است. مولکول‌های اسیدهای نوکلئیک در واقع زیست مولکول‌های بس پار یا پُلی‌ مری هستند که از واحد سازنده‌ای به نام نوکلئوتید تشکیل شده‌اند. نوکلئوتیدها در دی ان اِی چهار نوع هستند. تفاوت این چهار نوع در بازِ نیتروژنی آنهاست که ممکن است پورین (آدنین (A))، گوانین (G)، پیریمیدین (سیتوزین (C))، یا تیمین (T) باشد. این بازهای نیتروژنی به یک واحد قند دزوکسی ریبوز، و به واسطه‌ی آن به یک بنیان فسفات متصل‌اند. به این ترتیب هر نوکلئوتید از سه سازند باز، قند و فسفات تشکیل شده است. این امکان وجود دارد که سازند قندی هر نوکلئوتید به فسفات نوکلئوتید مجاور متصل شود و به این ترتیب ستونی مارپیچی از تکرار متناوب عناصر قند-فسفات ایجاد شود. همین اتصال باعث به وجود آمدن رشته‌های پُلی‌نوکلئوتیدی می‌شود که در یک انتهای آن‌ها بنیان فسفات به کربن شماره '5 قند اتصال دارد و در انتهای دیگر به کربن شماره '3 اتصال دارد. از آن جا که بازهای نیتروژنی نوکلئوتیدهای منفرد دارای نقشی در تشکیل ستون تکرار شونده‌ی پُلی‌ نوکلئوتید نیستند، در پُلی نوکلئوتیدهای طبیعی ترتیب قرارگیری چهار توع نوکلئوتید ممکن است ظاهری تصادفی داشته باشد بدون آن‌ که به نظم ستون خللی وارد شود. به این ترتیبِ خاصِ قرارگیریِ بازها در هر پُلی نوکلئوتید، توالی آن پُلی نوکلئوتید گفته می‌شود.
در سال 1953 میلادی جیمز واتسون و فرانسیس کریک ساختار فضایی دی ان اِی را تعیین کردند و نٌه سال بعد به همین دلیل جایزه‌ی نوبل به آن‌ها اعطا شد. بر اساس مدل تعیین شده توسط آن‌ها، هر مولکول دی ان اِی هم‌چون نردبانی مارپیچ از دو رشته پُلی نوکلئوتید تشکیل شده است که از راه پیوندهای بین بازهای نیتروژنی میان دو رشته به هم پیوند خورده‌اند، چنان که انتهای '5 هر رشته در مقابل انتهای '3 رشته‌ی دیگر قرار دارد. واتسون و کریک با توجه به رابطه‌ای که رقیب اتریشی الاصل آن‌ها، اروین شارگاف، مشاهده کرده بود، یعنی تساویِ مقدار بارهای Aبا T و نیز برابری G با C در همه‌ی نمونه‌های دی ان اِی، نتیجه گرفتند که پیوند بین دو رشته پُلی نوکلئوتید باید به وسیله‌ی اتصال بازهای مکمل برقرار شده باشد به این گونه که اگر در یک زنجیره، بازِ A وجود داشته باشد در زنجیره‌ی مقابل، بازِ T قرار گیرد، و اگر باز G موجود باشد، در طرف مقابل بازِ C پیوند یابد. بر اساس این مدلِ مکملی، با داشتنِ توالی بازها در یک زنجیره، می‌توان توالی بازها را در زنجیره‌ی مقابل تعیین کرد.
دی ان اِی در یاخته‌های هسته‌دار (یوکاریوت) به شکل رشته‌های ظریف و در هم پیچیده‌ای به نام شبکه‌ی کروماتین در درون هسته وجود دارد. تنها در مرحله‌ی متافاز تقسیم سلولی است که شبکه‌ی کروماتین (که در مراحل اولیه‌ی تقسیم دو برابر شده) به شدت پیرامون پروتئین‌های خاصی متراکم می‌شود و به صورت قطعات مشخصی به نام کروموزوم ظاهر می‌گردد تا تصنیف محتویات هسته به سهولت انجام گیرد.
مهندسی ژن‌ها

توضیح شکل: چگونگی در هم پیچیدن رشته‌ی DNA به شکل اَبَرمارپیچ‌های متعدد برای ایجاد کروموزوم در مرحله‌ی متافاز. شکلِ روشن‌ترِ مارپیچِ مضاعف در پایین نمایش داده شده است. ستون مارپیچ از سازند قند (S) و فسفات (P) تشکیل شده است. پیوند دو رشته‌ی پُلی نوکلئوتید نیز از پیوند بازهای نیتروژنی (C، T، G، A) مکمل است.
ژن واحد اطلاعاتی یاخته است. هر ژن که در واقع توالی ویژه‌ای از چندین بازِ متوالی در دی ان اِی است عهده‌دار تنظیم یک ویژگی است. ژن، نظارت خود را از راه تعیین چگونگی ساختنِ پروتئین‌هایی ویژه اعمال می‌نماید. روش کار این گونه است که هر سه بازِ نوکلئوتیدی نمایان‌گرِ جای‌گزینیِ یک اسید آمینه در زنجیره‌ی پروتئینی است. این پروتئین ممکن است در یاخته به منزله‌ی عنصری ساختاری به کار گرفته شود، یا ماده‌ای ترشحی و یا آنزیمی برای تنظیم واکنش زیست شیمیایی باشد. چون دی ان اِیِ مربوط به یاخته‌های هسته‌ دار در درون هسته و محل ساخته شدن پروتئین‌ها در سیتوپلاسم است، باید گفت که در این میانه واسطه‌ای اطلاعاتی وجود دارد که با نسخه برداری، بر اساس قوانین مکملی، از اطلاعات دی ان اِی، به سیتوپلاسم می‌رود و هم‌چون نقشه‌ای برای ساختن پروتئین مربوطه به کار می‌رود. به این واسطه‌ی اطلاعاتی، آر ان اِی، پیک، یا mRNA گفته می‌شود. آر ان اِی از لحاظ شیمیایی هم‌خانواده‌ی ‌دی ان اِی است اما در عین حال تفاوت‌هایی با آن دارد. از جمله‌ی این تفاوت‌ها این است که آر ان اِی معمولاً تک رشته‌ای است در حالی که دی ان اِی دو رشته‌ای یا مضاعف است.
البته از میان تقریباً سه میلیارد جفت بازی که در دی ان اِی انسان وجود دارد تنها در حدود سی‌صد میلیون جفت بازِ آن به منزله‌ی الگو برای ساختنِ mRNA به کار می‌رود. این به این معناست که ژن‌ها تنها ده درصدِ کلِ ژنوم، که عبارت است از تمام دی ان اِی موجود در کروماتین، را تشکیل می‌دهند و وظیفه‌ی نود درصد دیگرِ مخزن ژنتیکی معمایی است که زیست شناسان هنوز نتوانسته‌اند آن را حل کنند. در انسان، یک ژن به طور متوسط از سه کیلو یا سه هزار باز تشکیل شده است. البته هم‌چنان تمامِ این سه هزار جفت باز برای ساختن پروتئین به کار نمی‌روند. چندین باز در ابتدا و انتهای طول ژن نقش تنظیم کنندگی را ایفا می‌کنند، و چند باز به منزله‌ی نشانه‌هایی به این منظور کار می‌روند که آر ان اِی نسخه برداریِ خود را از آن نقاط آغاز یا در آن نقاط تمام کند. علاوه بر این، وقتی نسخه برداری آر ان اِی از روی دی ان اِی پایان یافت قسمت‌هایی از این نسخه که آر ان اِی هسته‌ای ناهم‌گن یا hnRNA نام دارد حذف می‌شود و mRNA نهایی باقی می‌ماند. همین mRNA است که به مثابهِ یک دستور کار برای ساختن یک پروتئین به کار می‌رود.
هنگامی که نسخه برداری صورت می‌گیرد دو رشته پُلی نوکلئوتید مانند زیپ به طور موقت از یک‌دیگر جدا می‌شوند و آر ان اِی از روی یکی از این دو رشته بر اساس قوانین مکملی نسخه‌ای بر می‌دارد. البته اگر آر ان اِی یک‌بار از یک رشته و باری دیگر از رشته‌ی مکمل آن نسخه برداری کند نتیجه‌ی کار دو چیز متفاوت خواهد بود. اما به راستی چگونه آر ان اِی، رشته‌ی مورد نظر یا رشته‌ی مناسب را از رشته‌ای که از روی آن نباید نسخه برداری شود یا از رشته‌ی نامناسب تشخیص می‌دهد؟ به نظر می‌رسد همان چند نوکلئوتیدِ نشان‌گری که در ابتدای ژن قرار دارند تعیین کننده‌ی این هستند که از کدام رشته باید نسخه برداری شود. البته اگر در یک ژن، رشته‌ی مناسبی برای نسخه برداری از اطلاعاتی خاص مشخص شود، دلیلی وجود ندارد که رشته‌ی مناسب برای بقیه‌ی ژن‌های آن مولکولِ دی ان اِی نیز همان رشته باشد. شاید بتوان گفت که به طور متوسط، رشته‌ی مناسبِ نیمی از ژن‌های یک مولکولِ دی ان اِی در یک رشته و رشته‌ی مناسبِ نیمی دیگر از ژن‌ها در مکمل آن است. به هر رو، مهندسان ژنتیک برای دست کاری ژن‌ها باید با چنین مولکول‌های بزرگ و پیچیده‌ای دست و پنجه نرم کنند. ابزار این پژوهش‌گران مجموعه‌ای از قیچی‌ها و چسب‌هاست، اما تنها شباهت این ابزار به قیچی یا چسب معمولی، کارِ آنهاست که عبارت است از بریدن پیوندها یا چسباندن مولکول‌ها. این ابزار در واقع همان آنزیم‌ها هستند که هر یک وظیفه‌ای خاص بر عهده دارند. مثلاً می‌دانیم که دسته‌ای از پُلی مرازها واسطه‌ی ساخته شدن یک مولکول دی ان اِی دو رشته‌ای از روی یک رشته پُلی نوکلئوتید هستند. اگزنوکلئازها نوکلئوتیدی را از یک انتهای زنجیره‌ی پُلی نوکلئوتید جدا می‌کنند در حالی که اندونوکلئازها زنجیر را از میان برش می‌دهند. ترمینال ترانسفرازها، یک نوکلئوتید به یک انتهای زنجیر می‌چسبانند و سرانجام لیگازها موجب پیوند مولکول‌های دی ان اِی به یک‌دیگر می‌شوند. ظاهراً با چنین جعبه‌ای از ابزار مجهز، مهندسان ژنتیک دیگر نباید غمی داشته باشند. اما کار به این آسانی‌ها هم نیست. مثلاً اگر برای استخراج یک قطعه دی ان اِی، یک اندونوکلئاز معمولی به کار رود وضعیت مشابه این است که گویی به جای حبه حبه کردن یک کله قند، آن‌را به خاکه قند تبدیل کنیم! به عبارتی دیگر، کار این قیچی‌ها چندان که باید اختصاصی نیست.
شاید بتوان تاریخ تولد مهندسی ژنتیک را اوایل دهه‌ی 1970 میلادی دانست که زمانی است که آنزیم‌های بسیار اختصاصی از باکتری‌ها استخراج شدند. این آنزیم‌ها که به آنزیم‌های انحصاری معروف شدند از انواع اندونوکلئازها هستند. اما تفاوتی که با اندونوکلئازهای معمولی دارند این است که فقط توالی‌های خاصی از نوکلئوتیدها را برش می‌دهند. به عنوان مثال، آنزیم Eco RI، که چنان‌که از نامش پیداست از اشریشیاکولی استخراج شده است، فقط می‌تواند پیوند میان نوکلئوتید گوانین‌دار و آدنین‌دار را بگسلد. تقارن میانیِ اکثر توالی‌هایی که آنزیم‌های انحصاری بر آن‌ها عمل می‌کنند از ویژگی‌های مرموز آن‌هاست، چنان‌که اگر رشته‌ی مکمل توالی نوکلئوتیدیِ ویژه‌ی آن‌ها را رسم کنیم مشاهده خواهیم کرد که در بسیاری از آن‌ها ترتیب نوکلئوتیدها در رشته‌ی مکمل درست برعکسِ ترتیب نوکلئوتیدها در رشته‌ی اول است. مثلاً در Eco RI، وقتی که رشته‌ی مکمل توالی میان نوکلئوتید گوانین‌دار و آدنین‌دار را رسم کنیم توالی میان نوکلئوتید آدنین‌دار و گوانین‌دار به دست می‌آید که عکس رشته‌ی اول است. ظاهراً این ویژگی بدان منظور است که اگر آنزیم انحصاری یک رشته پُلی نوکلئوتید را برش داد، بتواند همان توالی ویژه را در رشته‌ی مکمل بیابد و آن‌را نیز در مولکول دو رشته‌ایِ دی ان اِی ببرد. تاکنون بیش از دویست نوع آنزیم انحصاری شناخته شده است. قطعه قطعه کردن ژنوم با آنزیم‌های انحصاری، اولین مرحله در کار مهندسی ژنتیک است. از آن جا که در بیش‌ترِ این کارها به تعداد زیادی نسخه‌ی یک‌سان از یک یا چند قطعه‌ی معین نیاز است باید بتوان به نحوی قطعات دی ان اِی را تکثیر نمود. خوش‌بختانه طبیعت وسایلی در اختیار انسان قرار داده است که این نیاز را برآورده می‌سازند. این وسایلِ زیست شناختی، بردار نام دارند، که به طور خلاصه عبارتند از قطعاتی از دی ان اِیِ باکتریایی یا ویروسی که تواناییِ همانندسازی دارند.
پلاسمیدها از انواع بردارها هستند. این مولکول‌های دی ان اِی دو رشته‌ای، دارای ساختاری حلقه‌ای هستند، یعنی دو انتهای آزاد آن‌ها به هم متصل شده است. کار اصلیِ پلاسمیدها مقاوم ساختنِ باکتری در برابر برخی از انواع آنتی‌بیوتیک‌هاست، اما چند خصلت جنبی آن‌ها باعث شده است که به منزله‌ی بردار به کار روند. این ویژگی‌های جنبی عبارتند از نخست این‌که آن‌ها از رشته‌های کروماتین بسیار کوچک‌ترند و بنا بر این به راحتی از کروماتین تفکیک می‌شوند. دیگر این که به طور طبیعی طی فرایندی به نام جا به جایی یا ترانسفورماسیون از محیط، جذبِ باکتری‌ها می‌شوند. بنا بر این می‌توان آن‌ها را از یک باکتری استخراج کرد و به ‌آسانی به درون باکتری دیگری فرستاد. آخر این که پلاسمیدهایی که وارد باکتریِ دیگری شده باشند به راحتی همراه با چرخه‌ی زندگی باکتری میزبان همانند سازی می‌کنند و تکثیر می‌یابند. برای این که بتوان پلاسمیدها را به منزله‌ی بردار به کار برد نخست باید مثل یک جعبه دربِ آن‌ها را باز کرد و سپس تکه‌ی دی ان اِی مورد نظر خود را در آن قرار داد و سرانجام آن را بست. اگر پلاسمیدی را تحت تأثیر یک آنزیم انحصاری قرار دهیم حلقه مولکول‌های پلاسمید در یک نقطه گسسته می‌شود. حال اگر تکه‌ای از ژنوم مورد نظر، که چیزی جز تکه‌های دی ان اِی نیست، را که توسط همان آنزیمِ انحصاری قطعه قطعه شده است در محل گسستگی پلاسمید قرار دهیم و در واقع آن‌را جاسازی کنیم، پلاسمیدی با ترکیبی جدید و مختلط به دست خواهد آمد که پلاسمید نو ترکیب نامیده می‌شود.
مهندسی ژن‌ها

توضیح شکل: چگونگی جاسازی قطعه‌ای DNA درون پلاسمید به وسیله‌ی آنزیم انحصاری
چون تکثیر پلاسمیدها مستقل از تکثیر ژنوم باکتری صورت می‌گیرد می‌توان ترتیبی داد تا پلاسمیدهای مختلط یا نو ترکیب وارد باکتری‌ها شوند و بدین ترتیب پا به پای افزایش باکتری‌ها، پلاسمیدها نیز افزایش خواهند یافت، یعنی می‌توان باکتری‌ها را به کارخانه‌های تولید کننده‌ی پلاسمیدهای نو ترکیب تبدیل کرد. با این روش، پس از چندی در محیط کشت، نسخه‌های یک‌سان و متعددی از این پلاسمیدها به دست خواهد آمد. سپس می‌توان با روش‌هایی که خواهیم گفت هر یک از آن‌ها را از پلاسمیدهای نو ترکیبِ دیگر جدا و خالص کنیم. در ضمن، هر گاه لازم باشد می‌توان قطعه‌ی دی اِن اِیِ جاسازی شده را دوباره از درون پلاسمید بیرون آورد. برای این کار کافی است از همان آنزیم انحصاری استفاده کنیم. آنزیم باعث می‌شود که اتصال بین دی ان اِی و پلاسمید در همان نقاط بگسلد و این دو از یک‌دیگر جدا شوند. به روشی که در طی آن بتوان از یک عنصر تعداد بسیاری نسخه‌ی یک‌سان تهیه کرد دودمان سازی گفته می‌شود. عنصر اولیه ممکن است یک مولکول، یا یک یاخته، و یا حتی یک جان‌دار کامل باشد. البته گنجایش پلاسمیدها برای جاسازی قطعه‌های دی ان اِی محدود است، یعنی آن‌ها فقط می‌توانند آن قطعاتی از دی ان اِی را در خود نگاه دارند که یک صدم تا ده کیلو باز طول داشته باشند. این مشکل در بردارهای دیگری هم‌چون باکتریوفاژها تا حدودی رفع شده است، زیرا این ذرات ویروسی دی ان اِی خطی دارند و گنجایش نو ترکیبی آن‌ها ده تا بیست کیلو باز است. باکتریوفاژها به سیتوپلاسم باکتری‌ها نفوذ می‌کنند و در آن‌جا به تکثیر دی ان اِی نو ترکیب خود می‌پردازند.
برخی از بردارها که به رتروویروس‌ها شهرت دارند نه تنها وارد یاخته می‌شوند بلکه می‌توانند نسخه‌ای از اسید نوکلئیک خود را در ژنوم یاخته‌ی میزبان ادغام کنند. در چنین مواردی بردارها افزون بر دودمان‌سازی از قطعه‌های دی ان اِی یا در واقع علاوه بر تولید انبوه آن‌ها کاربردهای دیگری نیز دارند که مهمترین آن‌ها همان انتقال ژن‌ها از یاخته‌ای به یاخته‌ای دیگر است. اگر ژن مورد نظر را در بردار مناسبی که به طور طبیعی توانایی ورود به یاخته‌ی مقصد را داشته باشد قرار دهیم می‌توان از این بردار نو ترکیب برای جا دادنِ آن ژن در ژنوم یاخته بهره جست. اگر ترتیبی داده شود که بردار به یک یاخته‌ی جنسی وارد شود همه‌ی یاخته‌های موجود زنده‌ای که پس از گشن‌گیری از تکثیر این یاخته‌ی جنسی حاصل شود نسخه‌ای از این ژن خارجی را خواهند داشت. به چنین جان‌داری ترانس ژنتیک گویند. با این روش، گیاهان و جانوران ترانس ژنتیک گوناگونی که دارای ژن‌های کارآمدتر و در نتیجه دارای ویژگی‌های دلخواهی هستند به وجود آورده‌اند. کاربرد دیگرِ بردارها در ژن درمانی انسان است که در آن ژن‌های سالم، جای‌گزینِ ژن‌های معیوب برخی از یاخته‌های پیکری انسان می‌شوند. موانع قانونی و محدودیت‌های اخلاقی تا چندی پیش مانع از آن بودند که دست‌کاری ژن‌ها در انسان به گستردگی صورت گیرد، اما بالاخره انستیتو ملی بهداشت امریکا به محققین اجازه داد که از بردارهای نو ترکیب برای درمان سرطان و نوعی اختلال ارثی دستگاه ایمنی استفاده کنند. اما بازگردیم به آزمایش‌گاه. اگر یک مولکول دی ان اِی تحت تأثیر یک آنزیم انحصاری قرار گیرد، و قطعات انحصاری در بردارهای مناسبی تکثیر یابند، شلم شوربایی از قطعات مختلف دی ان اِی با طول‌های گوناگون (و درنتیجه جرم‌های گوناگون) حاصل خواهد شد. در نظر دانش‌مندان هم چیزی بدتر از بی‌نظمی نیست، بنا بر این باید بتوان به نحوی قطعه‌های یک‌سان را گروه گروه از قطعه‌های دیگر جدا کرد. یکی از روش‌های جدا سازی، کروماتوگرافی است. اما روش دیگری که در تکنولوژی زیستی کاربرد فراوان دارد الکتروفورز است. در این روش، مخلوط مورد بررسی را بر یک محیط نگاه دارنده قرا ر می‌دهیم. این محیط ممکن است لایه‌ای از کاغذ آغشته به ژل یا ماده‌ی مناسب دیگری باشد. پی اچ محیط را با تامپون خاصی در حد معینی تثبیت می‌کنیم تا اجزای مخلوط به نسبت خواص الکتروشیمیایی خود باردار شوند. آن‌گاه محیط نگاه دارنده را در یک میدان الکتریکی قرار می‌دهیم. در این میدان الکتریکی، مولکول‌هایی که برآیند بار آن‌ها منفی باشد به سوی قطب مثبت، و آن‌هایی که مثبت باشند به سوی قطب منفی می‌روند. در ضمن، مولکول‌هایی که جرم کم‌تری داشته باشند مسافت بیش‌تری را طی خواهند کرد. به این ترتیب اگر پس از چند ساعت، مولکول‌ها را با رنگ آمیزی‌های مناسبی آشکار کنیم خواهیم دید که مخلوط نامرتبی که ابتدا در محیط نگه دارنده گذاشته بودیم به دسته‌های جدا جدای گوناگونی تقسیم شده است و مولکول‌های هر قسمت، بنا بر بار الکتریکی و جرم خود در مواضع مختلفی از طول محیط نگه دارنده قرار گرفته‌اند. روشن است که مولکول‌های هر دسته‌ی جدا شده کاملاً به هم شبیه‌اند زیرا همگی نسخه‌های حاصل از دودمان سازی از یک قطعه‌اند. با اندازه گیریُ مسافتی که هر دسته از مولکول‌ها در میدان الکتریکی طی کرده‌اند و به کمک محاسبات کمّی، می‌توان مشخصات فیزیکی مولکول‌ها را تا حدودی محاسبه کرد.
مهندسی ژن‌ها

توضیح شکل: روش الکتروفورز. ابتدا مخلوط مورد بررسی را در محیطِ نگه دارنده قرار می‌دهیم و پس از تثبیت پی اچ، آن را در میدان الکتریکی قرار می‌دهیم. اجزای مخلوط، پس از چند ساعت بر حسب جرم و بار الکتریکی خود در میدان حرکت خواهند کرد. با بررسی قسمت‌های تفکیک شده می‌توان در صد تقریبی هر جزء را در مخلوط اولیه تخمین زد.
پس از آن که قطعه‌های مختلف دی ان اِی از یک‌دیگر جدا شدند باید آن‌ها را دسته بندی و ذخیره کنیم تا قادر باشیم به آسانی از آن‌ها استفاده کنیم. در این جاست که بایگانی ژنومی کاربرد پیدا می‌کند. بایگانی ژنومی عبارت است از مجموعه‌ی همه‌ی قطعه‌هایی که از تجزیه‌ی ژنوم کامل یک جان‌دار تحت تأثیر یک آنزیم انحصاری مشخص به دست آمده و در برداری معین جاسازی شده باشند. چنان که گذشت، آنزیم‌های انحصاری، هر چه نوکلئوتیدهای کم‌تری شناسایی کنند اختصاصی‌ترند. بنا بر این هنگامی که از یک آنزیم انحصاری اختصاصی تر استفاده می‌کنیم تعدادِ برش‌ها کم‌تر و قطعه‌هایی که از قطعه قطعه کردنِ ژنومِ موردِ نظر به وجود می‌آیند درشت‌تر خواهند بود. با دانستن این مسأله، و نیز طولِ تقریبی ژنوم جان‌داری که می‌خواهیم بایگانی‌اش کنیم، می‌توانیم آنزیم انحصاری مناسبی انتخاب کنیم تا نعداد قطعه‌ها از حد معقولی فراتر نرود. همین امر نشان می‌دهد که چرا تهیه‌ی بایگانیِ موجوداتِ پیچیده‌ای چون انسان دشوارتر است. در این گونه موجودات، اگر قطعه‌ها بیش از اندازه بزرگ و دراز باشند جاسازی قطعه‌ها در درون بردار و در نتیجه دودمان سازی از آن‌ها مشکل خواهد بود، و از سوی دیگر، اگر شمارِ قطعه‌ها بیش از اندازه زیاد باشد، نگه داری و ردیابیِ مجدد آن‌ها با دشواری همراه خواهد بود.
پس از آن که طول متوسط قطعه‌ها انتخاب شد عامل دیگری اهمیت پیدا می‌کند که عبارت است از کامل کردنِ بایگانی. به عبارت دیگر، باید کاری کرد که احتمال این که یک ژن یا قطعه‌ای از آن در بایگانی موجود باشد به بیش‌ترین حدِ خود برسد. مهندسان ژنتیک می‌توانند تعداد قطعات ضروری برای تهیه‌ی یک بایگانی کامل را بر اساس معادله‌ای که متخصصان آمار و احتمالات در اختیار آن‌ها گذارده‌اند محاسبه کنند. این معادله، تابع طول ژنوم، طول متوسط قطعه‌های بایگانی و احتمال کامل بودنِ بایگانی است که معمولاً این احتمال را برابر با نود و نُه درصد در نظر می‌گیرند. تهیه‌ی بایگانی ژنومی در صورتی فایده خواهد داشت که بتوانیم وجود قطعه یا قطعاتی از آن را در ژنوم جان‌داری تعیین کنیم، یا برعکس، مشخص کنیم که آیا قطعه‌ای از دی ان اِی یک جان‌دار در بایگانی جاسازی شده است یا نه. اصولاً برای شناسایی قطعه‌ی خاصی از دی ان اِی، آر ان اِی، یا پروتئین موجود در مخلوطی از قطعات مختلف دی ان اِی، آر ان اِی یا پروتئین، از شیوه‌ای به نام انتقال لکه‌ای استفاده می‌شود. به جدا سازی قطعه‌ای دی ان اِی از راه انتقال لکه‌ای روش سادرن گفته می‌شود. این کلمه به معنی جنوبی است، اما در اصل، نام محققی است که این روش را ابداع کرده است. ظاهراً هم‌کارانِ آقای سادرن با او سرِ شوخی داشته‌اند و بر همین اساس، جدا سازی قطعه‌های آر ان اِی به روش انتقال لکه‌ای را روش شمالی (نوردن) و جدا سازی پروتئین را روش غربی (وسترن) نامیده‌اند بدون این که این نام گذاری‌ها ربطی به جهت‌های جغرافیایی داشته باشد! در روش سادرن، مخلوط قطعات دی ان اِی را در ژل مناسبی الکتروفورز می‌کنند. پس از چند ساعت که قطعات باردار منفیِ دی ان اِی با سرعت‌های مختلف به سوی قطب مثبت حرکت کردند آن‌ها را به کمک بازهای ضعیف از حالت دو رشته‌ای به صورت تک رشته‌ای در می‌آورند. و با قرار دادنِ کاغذی مخصوص، لکه‌های دی ان اِی تفکیک شده را از ژل به کاغذ منتقل می‌کنند. آن‌گاه این دسته‌های دی ان اِی تک رشته‌ای را با کمک گرما در کاغذ تثبیت می‌کنند.
مهندسی ژن‌ها

توضیح شکل: روش سادرن برای تفکیک قطعه مشخصی از دی ان اِی: پس از تأثیر آنزیم انحصاری بر مولکول دی ان اِی، مخلوط به دست آمده را الکتروفورز می‌کنیم. بعد از توقف الکتروفورز، الگوی به دست آمده را دقیقاً به کاغذ منتقل می‌کنیم و آن را با حرارت تثبیت می‌نماییم. کاونده‌ی پرتوزا را به محیط می‌افزاییم و پس از پرتو نگاریِ، محلِ اتصالِ آن را آشکار می‌کنیم.
در این جاست که با استفاده از یک کاونده، قطعه‌ی موردِ نظرِ خود را در میان این لکه‌های متعدد، پیدا می‌کنیم. کاونده عبارت است از یک قطعه دی ان اِیِ تک رشته‌ای شناخته شده که معمولاً از بایگانی ژنومی برگرفته می‌شود و با فسفر پرتوزا نشان‌دار می‌شود. این کاونده را بر سطح کاغذ پراکنده می‌کنیم. چون این قطعه دی ان اِی تک رشته‌ای است، فقط به رشته‌ی مکمل خود اتصال پایداری پیدا می‌کند. بنا بر این، پس از مدتی که واکنش صورت گرفت، کاغذ را می‌شوییم تا کاونده‌هایی که هنوز رشته‌ی مکمل خود را پیدا نکرده‌اند از روی کاغذ برداشته شوند. سپس صفحه کاغذ را در مجاورت فیلم پرتونگاری قرار می‌دهیم. در این موقع، کاونده‌های پرتوزایی که به رشته‌ی مکمل خود متصل شده باشند مشخص می‌شوند و به این ترتیب، می‌توان دریافت که کدام قطعه یا قطعه‌های دی ان اِی، مکمل کاونده‌ی انتخاب شده هستند. فایده‌ی انتقال لکه‌ای آن است که اگر جهشی روی داده باشد با مشاهده‌ی تغییراتی در الگوی پرتو نگاری می‌توان دریافت که این جهش در کدام قطعه واقع شده است. به عبارتی دیگر، اگر ببینیم که کاونده‌ی شناخته شده‌ای نتوانسته است رشته‌ی مکمل خود را پیدا کند و یا به رشته‌ای متصل شده است که در حال طبیعی نمی‌توانست به آن متصل شود، متوجه می‌شویم که جهش روی داده است و ترتیب بازها در قطعه‌ی مورد نظر نسبت به طرح مکملِ دی ان اِیِ کاونده یا توالی شناخته شده توسط آنزیمِ انحصاری تغییر کرده است.
مواردی پیش می‌آید که قطعه‌ای دی ان اِی داریم اما نمی‌دانیم که به کدام جان‌دار تعلق دارد یا در کدام قسمت بایگانی قرار گرفته است. در این جاست که روش پرگنه دورگه مورد استفاده قرار می‌گیرد. با این روش می‌توانیم وجود توالی خاصی از نوکلئوتیدهای دی ان اِی را در گنه‌ها یا کُلُنی‌های باکتریایی تشخیص دهیم. برای این منظور، نخست باکتری‌های متعددی را که هر یک حاوی قطعه‌ای از یک بایگانی ژنومی باشند به صورت پرگنه‌های جداگانه در محیط‌های کشت رشد می‌دهیم. سپس با قرار دادن یک کاغذ صافیِ مخصوص، یاخته‌های باکتریایی پرگنه را به کاغذ جذب می‌کنیم، و سپس با گرما و مواد شیمیایی، باکتری‌ها را به کاغذ تثبیت می‌کنیم و می‌کشیم و سپس آن‌ها را تک رشته‌ای می‌کنیم. پس از آن که دی ان اِیِ موردِ‌ نظر را با افزودنِ فسفرِ پرتوزا نشان‌دار و نمونه‌های آن‌را به منزله‌ی کاونده به کاغذها اضافه کردیم، آن‌ها را می‌شوییم و در مقابل فیلم پرتونگاری قرار می‌دهیم. اگر پس از شست و شو، کاونده در کاغذی باقی مانده باشد در می‌یابیم که پرگنه مربوطه دارای توالی مکمل دی ان اِیِ مورد نظر ما بوده است. با همین روش می‌توانیم قطعات ناشناخته‌ی دی ان اِی را نشان‌دار کنیم و در بایگانی‌های ژنومی به دنبال نسخه‌اشان بگردیم. اگرچه با روش‌هایی که گفته شد می‌توان قطعات دی ان اِی را از درون یاخته‌ها استخراج، شناسایی و جا به جا کرد اما هنوز به روش‌هایی که بتوان با آن‌ها تک تک حروفِ این جملات وراثتی را تعیین کرد پی برده نشده است. به عبارت دیگر، چگونگی تعیین دقیق توالی بازهای نیتروژنی در طول فطعات دی ان اِی شرح داده نشده است. برای تعیین توالی بازها در یک قطعه دی ان اِی باید تعداد زیادی از آن فطعه داشته باشیم و این نیز از طریق به کارگیری بردارها و روش‌های دودمان سازی ممکن است. وقتی نسخه‌های متعددی از دی ان اِی در دست باشد می‌توان به روش‌های مختلفی ترتیبِ قرار گیریِ بازها را در آن تعیین کرد که معروف‌ترین آن‌ها روش شیمیایی مَکسَم و گیلبرت و دیگری روش آنزیمی سَنگِر است.
تعیین توالی ژنوم انسان، ژن‌های بسیاری را به دانشمندان معرفی خواهد کرد که هنوز وظیفه‌اشان مشخص نیست. هم‌اکنون نیز بیماری‌های ژنتیکی متعددی وجود دارند که هنوز روشن نشده است ناشی از اختلال کدام ژن هستند. افزون بر این، فرآورده‌های پروتئینی زیستی پُرشماری وجود دارند که محل ژن آن‌ها در طول کروموزوم‌ها مشخص نشده است. بنا بر این پیش از تعیینِ توالی قطعه‌های مختلف ژنوم انسان و دیگر جان‌داران، تعیین وضعیت ژن‌ها در طول رشته‌های دی ان اِی یا تعیین نقشه‌ی ژن هدف مهم‌تری است که بسیاری از مهندسان ژنتیک و پزشکان در پیِ آنند. برای تهیه‌ی نقشه‌ی ژن اگر بدانیم که محصول پروتئینی آن ژن چیست و بتوانیم دی ان اِی پیک آن را از سیتوپلاسم استخراج کنیم کار تا حدودی ساده‌تر می‌شود، بدین معنی که نخست، آر ان اِیِ پیک مربوطه را تحت تأثیر آنزیم ترانس کزیپیتاز معکوس قرار می‌دهیم. معکوس از این رو که کار آن برعکس نسخه برداری است، یعنی به جای آن که آر ان اِی را از روی الگوی دی ان اِی بسازد، دی ان اِیِ مکملی را بر روی آر ان اِی پیک تولید می‌کند. از این دی ان اِی مکمل یا cDNA می‌توان به منزله‌ی کاونده استفاده کرد، و در مرحله‌ی متافاز تقسیم یاخته که کروموزوم‌ها ایجاد می‌شوند، آن‌را در مجاورت دی ان اِیِ یاخته قرار داد. وقتی این کاونده، توالیِ مکمل خود را در یکی از کروموزوم‌ها پیدا کرد و بدان پیوست، می‌توان با گرفتنِ تصویر پرتونگاری و مقایسه‌ی آن با تصویر میکروسکوپی کروموزوم‌ها، محل تقریبی یک ژن را به کروموزوم به خصوصی نسبت داد.
تاکنون بیش از یک‌صد ژن در انسان نقشه برداری شده است. برای نمونه هم‌اکنون ژن سازنده‌ی هورمون رشد در نوار بیست و یک بازوی بلند کروموزوم هفده تعیین شده است، و امروزه می‌دانند که ژن‌های دو جزء پروتئینی هموگلوبین خون، یعنی آلفا گلوبین و بتا گلوبین، به ترتیب در نوار دوازده بازوی کوتاه کروموزوم شانزده و نوار دوازده بازوی کوتاه کروموزوم یازده قرار دارند. اما در صورتی که آر ان اِی پیک ژن مورد نظر موجود نباشد یا به عبارت بهتر اصلاً ندانیم که فرآورده‌ی پروتئینی ژن مورد نظر چیست باید به روشی دیگر عمل کرد. در این جاست که نقشه‌های انحصاری کاربرد پیدا می‌کنند. نقشه‌ی انحصاری عبارت است از الگوی نسبتاً ثابتی که از قطعه قطعه کردن ژنومِ یک جان‌دار توسط یک آنزیم انحصاری مشخص به دست می‌آید. به عنوان نمونه، ژنوم جان‌داری را تحت اثر آنزیم انحصاری اشریشیاکولی قرار می‌دهیم. چون این آنزیم شش نوکلئوتید را شناسایی می‌کند پس به طور متوسط در هر چهار هزار و نود و شش جفت پیوند نوکلئوتیدی یک برش ایجاد می‌کند. پس اگر فرض کنیم که ژنوم این جان‌دار دارای طولی برابر با یک میلیارد جفت باز باشد به طور تقریبی در حدود دویست و چهل و چهار هزار برش در آن ایجاد خواهد شد. این برش‌ها در مواضع نسبتاً ثابتی صورت می‌گیرد و به الگویی که از محل این برش‌ها به ‌دست می‌آید نقشه‌ی انحصاری برای آنزیم انحصاری اشریشیاکولی گفته می‌شود. نقشه‌های انحصاری آنزیم‌های دیگر را می‌توان به همین ترتیب تهیه و قطعات حاصل از آن‌ها را در بایگانی‌های ژنومی ذخیره کرد. اما باید توجه داشت که ژنوم افراد یک گونه کاملاً یک‌سان نیست. برای مثال، اگرچه در انسان، تمامِ هموگلوبین‌ها ساختاری مشخص و یک‌سان دارند و در نتیجه ژنِ آن‌ها در انسان‌های طبیعی چه از لحاظ توالی و چه از لحاظ وضعیت در کروموزوم یک‌سان است، اما تعداد معدودی از ویژگی‌های جزئی مثل گروه خون یا رنگ چشم در افراد مختلفِ یک گونه تفاوت‌هایی دارد و همین تفاوت‌های جزئی موجد اختلاف بین افراد یک گونه است. البته محل ژن یا ژن‌های مسئول ویژگی‌های جزئی تغییری نمی‌کند اما اختلافاتی جزئی در توالی نوکلئوتیدها یافت می‌شود. این تفاوت‌های طبیعی را تفاوت عادی ژن‌ها گویند.
این تغییرات را معمولاً با مشاهده‌ی تغییر نقشه‌ی انحصاری می‌توان تشخیص داد. از مدت‌ها پیش متخصصان ژنتیک دریافته بودند که یک آنزیم انحصاری به خصوص ممکن است در برخی از افراد، یک محل را برش دهد در حالی که در برخی دیگر از افراد محلی دیگر را برش دهد. نتیجه‌ای که دانشمندان گرفتند این بود که توالی نوکلئوتیدهای آن محل در افراد گوناگون متغیر است و بدین ترتیب، نقشه‌های انحصاری افرادِ مختلف دارای تفاوت‌هایی جزئی است. از این جا بود که مفهوم تفاوت طول قطعه‌ی انحصاری پا گرفت. تفاوت نقشه‌ی انحصاری، ناشی از تفاوت طول قطعه‌هایی است که از برش آنزیم انحصاری مربوطه ایجاد می‌شود. با بررسی این تفاوت‌ها در توالی نوکلئوتیدها (ژنوتیپ‌ها) و مقایسه‌ی آن با تفاوت‌هایی که در خصیصه‌های ظاهری (فنوتیپ) افراد وجود دارد می‌توان وضعیت بسیاری از ژن‌ها را مشخص کرد. تاکنون بیش از سی‌صد و پنجاه تفاوت در طول قطعه‌های انحصاری شناخته شده است. به این ترتیب می‌توان بدونِ دانستنِ فرآورده‌ی پروتئینی یک ژن، موضع تقریبی آن را پیدا کرد. کشف ژن بیماری فیبروز کیستی مثال خوبی از چگونگی به کارگیریِ این تفاوت‌ها در تعیینِ وضعیت ژن‌هاست. این بیماری کشنده ناشی از اختلال کارکرد غده‌های برون‌ریز (لوزالمعده، مخاط ریه، و غده‌های عرق) است، و از رایج‌ترین بیماری‌های ارثی در سفید پوستان به حساب می‌آید. در سال هزار و نُه‌صد و هشتاد و نُه میلادی با بررسی تفاوت طول قطعه‌های انحصاری در بیماران، وضعیت تقریبی ژن دگرگون شده در کروموزوم هفت تعیین شد. سپس با تعیین توالی بازها در آن ناحیه از کروموزوم و با شناسایی توالی‌های شاخص آغاز و پایان یک ژن، توانستند توالی کامل ژن معیوب را در افراد بیمار و اشخاص سالم تعیین کنند، و دریابند که این ژن مسئول ساختن یکی از پروتئین‌های غشایی یاخته‌هایی است که وظیفه‌ی انتقال یون‌ها را به عهده دارند. دانشمندان توانستند آرایش سه بُعدی این پروتئین را تعیین کنند و دریابند که در بیماران مبتلا، چه تغییری باعث شده است که این پروتئین نتواند وظیفه‌ی خود را به درستی انجام دهد. ابتکارات و ابداعات دانشمندان زیادی در زمینه‌های مختلفِ زیست شناسی مولکولی، ابزارهای مختلفی برای دست‌کاریِ برنامه‌ی ژنتیکی انسان و دیگر جان‌داران به دست داده است. اصول مهندسی ژنتیک این امکان را برای ما فراهم آورده است تا در جان‌داران گوناگون تغییراتی ایجاد کنیم که هزاران هزار سال طول می‌کشید تا در مسیر تکامل طبیعی به وجود آید. البته اگر نگران استفاده‌ی غیر اخلاقی از این توانایی باشیم باید مهندسی ژنتیک را تیغی دو لبه بنامیم. اما تاکنون نوسعه‌ی علم ژنتیک و فن مهندسی ژنتیک و بررسی چگونگی پژوهش‌های به ظاهر انتزاعیِ دانشمندان و اثری که بر بهبود و ارتقاء کیفیت زندگی انسان داشته‌اند نه تنها مایه‌ی نگرانی نبوده‌اند بلکه کاربردی شایان داشته‌اند.



 

 



ارسال نظر
با تشکر، نظر شما پس از بررسی و تایید در سایت قرار خواهد گرفت.
متاسفانه در برقراری ارتباط خطایی رخ داده. لطفاً دوباره تلاش کنید.
مقالات مرتبط