مقايسه رقيق کننده هاي مختلف اسپرم خروس بومي دررقت هاي مختلف اسپرم طي دو زمان تلقيح

چکيده

به منظور تعيين مناسب ترين رقيق کننده هاي مني از بين رقيق کننده هاي بلتسويل، رينگر وشير و مقايسه نسبت هاي مختلف رقيق کننده هاي جهت رقيق سازي (نسبت يک به يک، يک به دو مني به رقيق کننده هاي)، برباروري و نيز بررسي تاثير زمان نگهداري مني (بدون نگهداري و يا 24 ساعت نگهداري) بر درصد باروري، در مرکز اصلاح نژاد مرغ بومي واقع در استان اصفهان، اين مطالعه انجام شد. اين تحقيق شامل 11 تيمار و در هر تيمار 3 قطعه خروس به عنوان تکرار و 24 قطعه مرغ و جمعاً 264 قطعه مرغ بود. پس از جمع آوري مني، مايع بدست آمده به نسبت هاي يک به يک و يا يک به دو با رقيق کننده هاي مختلف رقيق شده و تلقيح بلافاصله يا پس از 24 ساعت نگهداري در دماي 5 درجه سانتي گراد انجام شد. نگهداري مني بعد از 24 ساعت باعث کاهش باروري شد. اثر رقيق کننده هاي مختلف و همچنين زمان هاي تلقيح بر صفت باروري معني دار بود (P<0/01) . بين نسبت هاي يک به يک و يک به دو رقيق کننده ها اختلاف معني داري وجود نداشت. در بين رقيق کننده ها زماني که از مني تازه بهره گرفته شد، استفاده از رينگر يک به يک بالاترين درصد باروري را موجب گرديد (P<0/01) و بين بلتسويل با شاهد اختلاف معني داري وجود نداشت ولي استفاده از شير به عنوان رقيق کننده ها باعث کاهش باروري گرديد (P<0/01). به نظر مي رسد که براي نگهداري مني هيچ کدام از رقيق کننده هاي ذکر شده مناسب نبوده و استفاده از رينگر به عنوان رقيق کننده باعث بالاترين درصد باروري مي شود.
کلمات کليدي: رقيق کننده، باروري، اسپرم، تلقيح مصنوعي

مقدمه

امروزه از تلقيح مصنوعي به عنوان روش متداول در صنعت پرورش طيور استفاده مي شود که با کمک آن علاوه بر شجره دار نمودن گله مي توان عملکرد توليد مثل را درمرغ هاي گوشتي به حدمطلوب رساند و از نژادهاي برتر ازنظر ژنتيکي، در تلقيح استفاده نمود (9). تلقيح مصنوعي اجازه مي دهد که پرنده در گروههاي کوچکي نگهداري شوند (14). علاوه بر آن استفاده از رقيق کننده هاي مناسب و ميزان رقيق کردن مني مي تواند اصلاح گران طيور را در پيشبرد برنامه هاي بهنژادي ياري نمايد. اين امر به ويژه درکشور ما مي تواند مورد توجه واقع شود. استفاده از رقيق کننده ها مناسب باعث کاهش هزينه تلقيح مصنوعي شده (2)، علاوه بر آن در يک رقيق کننده مناسب از موادي استفاده مي شود که هم انرژي مورد نياز اسپرم را تأمين کرده و هم باعث محافظت از آن شوند (4). در ترکيب رقيق کننده ها، معمولاً از موادي استفاده مي شود که در نتيجه تجزيه مني خروس و بوقلمون بدست آمده اند. با استفاده از رقيق کننده ها مناسب مي توان بدون افزايش تعداد اسپرم، از دزهاي بيشتري درتلقيح استفاده نموده و ضمن افزايش تعداد نتايج شجره دار روند برنامه هاي ژنتيکي را تسريع بخشيد (9).
تا کنون يک رقيق کننده مناسب که براي اسپرم همه گونه هاي پرندگان مناسب باشد، معرفي نشده است (7). ترکيباتي که به عنوان رقيق کننده معرفي شده اند، متعدد مي باشند. از جمله اين رقيق کننده ها مي توان به بلتسويل، رينگر و شير اشاره کرد. اثر اين رقيق کننده ها بر باروري و ميزان مناسب رقيق سازي مني مورد بحث محققين مي باشد (2).
بنابراين اهداف اين تحقيق عبارتند از:
تعيين مناسب ترين رقيق کننده ها از بين رينگر، بلتسويل و شير براي ابقاء توان باروري تخم مرغ هاي بومي، تشخيص مناسبترين غلظت رقيق کننده مني با استفاده از رقيق کننده مربوطه وبررسي تاثير زمان نگهداري مني بر باروري مرغان مادر بومي.

مواد و روش ها

در انجام اين تحقيق از 33 قطعه خروس و 264 قطعه مرغ بالغ نژاد بومي اصفهان، در سنين بين 30 تا 40 هفتگي، در مرکز اصلاح نژاد مرغ بومي وابسته به امور دام جهاد کشاورزي اصفهان استفاده شد. طول مدت روشنايي سالن نگهداري خروس ها 16 ساعت در روز بود.
رقيق کننده هاي مورد استفاده شامل بلتسويل با pH=7/51 ، رينگر با pH=7 ، شير هموژنيزه و کم چرب و آب مقطر با pH=7 بودند. تخم مرغ ها با استفاده از گاز فرمالدئيد به مدت 5 دقيقه ضدعفوني شدند. در اين طرح از 11 تيمار و براي هر تيمار 3 قطعه خروس به عنوان تکرار و براي هرخروس 8 قطعه مرغ در نظر گرفته شد. در کل براي هر تيمار از 24 مرغ استفاده شد. مرغ هايي براي خروسها در نظرگرفته شدند که والدين آنها و يا يکي ازوالدين آنها مشترک نباشند، تا از همخوني که باعث کاهش باروري مي شود، جلوگيري شود. اسپرم گيري از خروس ها به مدت 3 هفته و هر هفته دو بار انجام گرفت. شيوه اسپرم گيري به اين نحو بود که پرهاي ناحيه مقعد چيده شده و پشت خروس، زيررانها و زير بالهاي آنها ماساژ داده مي شدو در مرحله آخر بعد از فشار دادن به اطراف کلوآک انزال صورت مي گرفت (2). ساعت 15/00 هر روز براي جمع آوري مني در نظر گرفته شد. به جهت اطمينان از باروري طبيعي خروسها اسپرم هاي جمع آوري شده مورد ارزيابي (مورفولوژي و motility) قرار گرفتند. به منظور رقيق کردن مني، از رقيق کننده هاي مختلف رينگر، بلتسويل و شير به نسبت 1 به 1 و 1 به 2 و براي گروه شاهد از مني رقيق نشده استفاده شد. مني در دو زمان تلقيح شد، براي شرايط زماني صفر مني را فوري بعد از رقيق کردن استفاده کرده و براي شرايط زماني 24 ساعت، مني در درجه حرارت 5 درجه در يخچال نگهداري مي شد و پس از گذشت اين زمان تلقيح انجام مي گرديد. به منظور تلقيح، مقدار 0/05 ميلي ليتر مايع مني با استفاده از سرنگ انسولين به عمق 2 تا 3 سانتي متري کلوآک داخل واژن تخليه مي گرديد.
به مدت 14 روز در دو نوبت ساعت 11/00 و ساعت 18/00 مجموعاً 1823 عدد تخم مرغ جمع آوري و در سردخانه در دماي 15 درجه سانتي گراد و رطوبت 75 تا 80 درصد ذخيره شد. بعد از ذخيره سازي، تخم مرغ ها 18 روز داخل ستر با رطوبت 52 درصد و حرارت 37/7 درجه سانتي گراد نگهداري شدند و بعد از 19 روز تخم مرغ ها به هچر انتقال داده شده و به مدت سه روز دراين دستگاه قرار گرفتند. دماي هچر در 24 ساعت اول 31/5 درجه و رطوبت 64 درصد و در روزهاي دوم و سوم در دماي 33 درجه سانتي گراد ودر رطوبت 72 درصد تنظيم گرديد (3).
بعد از پايان 21 روز با توجه به معيارهاي زير درصد باروري تعيين گرديد:
1) نبود حلقه خوني که نشان دهنده ناباروري تخم مرغ يا مردن جنين در روز اول انکوباسيون است.
2) وجودحلقه خوني يا مشاهده يک جنين کوچک نشان دهنده مرگ جنين در سه روز اول انکوباسيون و وجود جنين هاي مرده اي که پر و پنجه هاي پا تشکيل نشده، اما ران تشکيل شده است نشان دهنده مرگ بين 2-7 روزگي است.
3) وجود جنين هاي مرده اي که داراي پر بوده و پنجه هاي پا تشکيل شده، اما کيسه زرده جذب حفره شکمي نشده اند که نشان دهنده مرگ بين 8-18 روزگي است.
4) وجود جنين هاي مرده اي که در آن کيسه زرده به طور کامل يا مقداري از آن جذب حفره شکمي شده باشد، که نشان دهنده مرگ بين 19-21 روزگي است (13).

روش تجزيه و تحليل آماري

تجزيه و تحليل داده هاي اين آزمايش در قالب يک طرح کاملاً تصادفي به روش فاکتوريل با آرايش 2×2×3 انجام گرديد، ميانگين ها بر اساس آزمون چند دامنه اي دانکن در سطح احتمال 5 درصد مقايسه شدند و براي ترسيم جدول هاي گرافيکي از نرم افزار کواتروپرو استفاده گرديد. جهت انجام محاسبات آماري پژوهش از نرم افزار کامپيوتري SAS استفاده شد.
Yikjl=M+Ai+Bj+Ck+ABij+
ACik+BCjk+ABCikj+Eijkl
Yijkl: مقدار هر مشاهده-M : ميانگين کل- Ai : اثر مربوط به دو سطح نگهدارنده (غلظت)- Bj : اثر مربوط به 2 زمان تلقيح - Ck : اثر مربوط به 3 محلول رقيق کننده - ABij : اثر متقابل عامل A و عامل ACik-B اثر متقابل عامل A و عامل BCjk-C : اثر متقابل عامل B و عامل ABCijk-C اثر متقابل عامل A و عامل B و عامل Eijkl-C خطاي آزمايش.

نتايج

1- اثر نوع رقيق کننده

استفاده از رقيق کننده هاي مختلف شامل شير، بلتسويل و رينگر نسبت به شاهد کاهش معني داري (P<0/01) در باروري به وجود آورد، در صورتي که تفاوتي در انواع رقيق کننده ها وجود نداشت (جدول 1). اگر علاوه بر نوع رقيق کننده، زمان ذخيره سازي مني نيز در نظر گرفته شود (جدول 1)، مشخص مي شود که استفاده از رقيق کننده رينگر باعث بالاترين درصد باروري پس از گروه شاهد شده و بين درصد باروري ايجاد شده در نتيجه استفاده از رينگر با شاهد اختلاف معني داري وجود ندارد. بين انواع رقيق کننده ها ونسبت هاي مختلف رقيق کنندگي بر روي درصد باروري اختلاف معني داري وجود ندارد و بيشترين درصد باروري با استفاده از مني رقيق نشده و بدون ذخيره سازي بدست آمد (جدول 1). بيشترين درصد باروري با استفاده از محلول رينگر به نسبت يک به يک و بدون ذخيره سازي حاصل شد که حتي از گروه شاهد نيز بيشتر بود. با استفاده از رينگر به نسبت يک به دو، بدون ذخيره سازي، نيز باروري بالايي به دست آمد (جدول 1).

2- اثر زمان

ذخيره سازي
ذخيره سازي مني به مدت 24 ساعت در دماي 5 درجه سانتي گراد، باروري را بطورمعني داري کاهش داد (P<0/01) (جدول1). با مراجعه به جدول 1، تاثير متقابل طول مدت ذخيره سازي و نسبت استفاده از رقيق کننده، تاثير متقابل طول مذت ذخيره سازي و نوع رقيق کننده، تاثير متقابل مدت زمان، نوع و نسبت استفاده از رقيق کننده، نشان داده مي شود که با وجود استفاده از ريه نسبت هاي مختلف آن جهت رقيق سازي، باروري بعد از 24 ساعت ذخيره سازي کاهش مي يابد.

3- نسبت استفاده از رقيق کننده

نتايج ارائه شده در جدول 1 نشان مي دهند که درصد باروري در نتيجه رقيق کردن مني نسبت به شاهد کاهش معني داري داشته (P<0/01)، در حالي که بين باروري ايجاد شده در نتيجه استفاده از نسبت هاي يک به يک و يا يک به دو از لحاظ آماري اختلاف معني داري مشاهده نمي شود. جدول 1 نشان مي دهد که بين انواع رقيق کننده ها و نسبت هاي مختلف استفاده از آنها اختلافي مشاهده نمي گردد. اگر علاوه بر نسبت استفاده از رقيق کننده ها و نوع آن، زمان ذخيره سازي مني رقيق شده در نظر گرفته شود (جدول 1)، مشاهده مي شود که در هر کدام از رقيق کننده ها بين نسبت هاي يک به يک و يک به دو اختلاف معني داري وجود ندارد.

بحث و نتيجه گيري

1- نوع رقيق کننده

استفاده از رقيق کننده هاي مختلف شامل شير، بلتسويل و رينگر نسبت به شاهد باعث کاهش قابل توجهي در باروري شد (P<0/01). در بين رقيق کننده ها، استفاده از رينگر باعث بالاترين درصد باروري شد. با توجه به اينکه استفاده از اين رقيق کننده به نسبت يک به يک و حتي يک به دو باعث باروري بالايي شد، هنگامي که حجم مني گرفته شده از خروس در حد کمي بوده (کمتر از 0/1cc)، استفاده از اين نسبت هاي رقيق کننده رينگر، به نظر مناسب مي رسد لذا نتيجه گيري شد که اين محلول از لحاظ فيزيولوژيک، باعث حفظ ساختار و توان باروري اسپرم شده است. در تحقيقي که در همين زمينه در ايستگاه تحقيقاتي مرغ بومي فارس به عمل آمده است (3)، نتيجه گيري شده است که استفاده از محلول رينگر توان باروري اسپرم را کاهش داده که اين نتيجه با نتايج تحقيق حاضر مطابقت ندارد و احتمالاً اين اختلاف به علت تفاوت در محيط آزمايش بوده است.
استفاده از رقيق کننده بلتسويل (به نسبت هاي يک به يک و يک به دو) نشان دهنده آن است که بين نسبت هاي مختلف اين رقيق کننده بر باروري اختلاف معني داري وجود ندارد و زماني استفاده از رقيق کننده بلتسويل باروري مطلوبي به دنبال خواهد داشت که از مني بدون ذخيره سازي استفاده گرديد، به طوري که باروري در اين حالت با شاهد، اختلاف معني داري نداشت.
نتايج به دست آمده از تحقيقات مختلف در مورد اين رقيق کننده با يکديگر مطابقت ندارد. در برخي تحقيقات با استفاده از رقيق کننده بلتسويل، کاهش باروري مشاهده گرديده است (14). در تحقيق ديگر بعد از 48 ساعت نگهداري با استفاده از رقيق کننده بلتسويل، مشاهده شدکه باروري به ميزان 64 درصدکاهش يافته است (15) و برخي ديگر استفاده از اين رقيق کننده را براي ذخيره سازي مني مناسب تشخيص داده اند (12)، که احتمالاً دلايل اختلاف نتايج گزارش شده با اين تحقيق، مربوط به مدت زمان کمتر ذخيره سازي مني ونگهدراي مني دردماي بالاتر (15 درجه سانتي گراد) مي باشد که اين امر شوک سرمايي اسپرم را برطرف مي کند. در اين تحقيق با توجه به pH مني، که از کمي اسيدي تا کمي قليايي بود (4)، براي نگهدارنده بلتسويل با استفاده از اين pH ، باروري بالايي (92 درصد) گزارش شده است (16).
در اين تحقيق استفاده از شير باعث کاهش باروري گرديد (P<0/05) و بين استفاده از نسبت هاي مختلف آن (يک به يک و يک به دو) اختلاف معني داري وجود نداشت. گزارشات ديگر حاکي از آن است که زماني که از شير پاستوريزه به منظور رقيق کردن استفاده مي شود، باروري حاصل شده تقريباً معادل با زماني است که اسپرم خالص و تازه مورد استفاده قرار گرفته بود (1) احتمالاً دلايل اين اختلاف نتيجه را مي توان به اختلاف گروه هاي نژادي (خارجي وبومي) نسبت داد.
بنابراين استفاده از شير اغلب زماني توصيه مي شود که رقيق کننده مناسب ديگري در دسترس نباشد.

2- اثر زمان ذخيره سازي مني

بعد از 24 ساعت ذخيره سازي مني در دماي 5 درجه سانتي گراد باروي بطور معني داري (P<0/05) کاهش يافته که با نتايج ساير تحقيقات مطابقت دارد (5، 8، 10، 11، 15، 17، 18).
در مجموع نتيجه گيري مي شود که اسپرم خروس نژاد بومي اصفهان، مناسب جهت ذخيره سازي با استفاده از رقيق کننده هاي نظير شير، بلتسويل و رينگر نبوده و شوک سرمايي (نگهداري در دماي پايين) به شدت بر خصوصيات باروري اسپرم موثر است. بعد از 24 ساعت اسپرم مانند ساير سلول هاي سوماتيک از شوک سرمايي دچار آسيب هايي از جمله تخريب اسپرم، کاهش تعداد کل اسپرم (به دليل کمک شدن اکسيژن) و افزايش نفوذ پذيري غشا مي شود که منجر به تخريب اسپرم مي گردند.

3- نسبت استفاده از رقيق کننده

به دليل بالا بودن تعداد اسپرم از رقيق کننده مني براي کاهش غلظت اسپرم استفاده مي شود. در اين تحقيق مشاهده گرديد که در نتيجه رقيق کردن مني، باروري کاهش قابل توجهي يافت (P<0/01). در حالي که بين باروري ايجاد شده در نتيجه استفاده از نسبت هاي يک به يک يا يک به دو اختلاف معني داري مشاهده نشد. در يک تحقيق، تا نسبت يک به چهار، مني به رقيق کننده،در باروري تغييري ديده شد و بيش از آن باعث کاهش باروري بود (8) در تحقيقي ديگر رقيق سازي به نسبت يک به پنج (مني به نگهدارنده بلتسويل) باعث کاهش معني دار تعداد اسپرم هاي مرده در مقايسه با نمونه هاي رقيق نشده گرديد (6).
در مجموع چون بين نسبت هاي يک به يک و يک به دو بر درصد باروري اختلاف معني داري مشاهده نشد، مشخص شد که حجم اسپرم براي باروري مطلوب حتي با دو برابر رقيق کردن مني براي باروري کافي بوده و در شرايطي که حجم مني کم است آنها را مي توان تا دو برابر رقيق کرده و علاوه بر اينکه تلقيح به راحتي انجام مي پذيرد، مي توان مني رقيق شده را به مرغ هاي بيشتري تلقيح نمود بدون اينکه درصد باروري تغيير يابد.
منابع
1- رشيدي ه. 1371. کالبد شناسي پرندگان اهلي. چاپ اول. انتشارات دانشگاه چمران، صفحه 262.
2- ميرعبدالباقي ژ. 1377. جزوه آموزشي تلقيح مصنوعي طيور، صفحه 31.
3- نحوي م.ع. 1379. گزارش اجمالي از تلقيح مصنوعي در مرکز مطالعات مرغ بومي فارس. معاونت امور دام جهاد فارس، صفحه 12.
4- هاشمي م. 1370. فيزيولوژي توليد مثل و تلقيح مصنوعي. چاپ اول . انتشارات فرهنگ جامع، صفحه 302.

پی نوشتها:

*استاديار گروه علوم دامي دانشکده کشاورزي دانشگاه آزاد اسلامي واحد خوراسگان
** کارشناسي ارشدعلوم دامي
***استاديار گروه علوم دامي دانشکده کشاورزي دانشگاه صنعتي اصفهان
**** عضو هيات علمي مرکز تحقيقات کشاورزي و منابع طبيعي اصفهان

منبع:نشريه پژوهش در علوم کشاورزي جلد4 شماره1
/خ