روش های تشخیص جهش های ناخواسته
ویژگی CRISPR/Cas9 تحت تأثیر عوامل مختلفی مانند غلظت کمپلکس Cas9/sgRNA و ویژگی‌های سایت‌های خارج از هدف قرار می‌گیرد. جهش خارج از هدف یک نگرانی اساسی در مورد توسعه سیستم CRISPR/Cas9 در گیاهان است. فراوانی جهش های نامطلوب در بسیاری از گیاهان کم گزارش شده است. بنابراین، CRISPR/Cas9 در گیاهان اختصاصی تر از سلول های انسانی است. در اکثر مطالعات CRISPR/Cas9 در گیاهان، فراوانی پایین جهش خارج از هدف گزارش شده است که ممکن است به دلیل وقوع آن در مناطق غیر کدکننده و در نتیجه عدم توانایی در تشخیص اثرات خارج از هدف در فنوتیپ باشد. شناسایی دقیق مکان های احتمالی خارج از هدف یک چالش مهم در زمینه ویرایش ژنوم است. در گیاهان عالی، جهش های نامطلوب ناشی از سیستم CRISPR/Cas9 به طور کلی نادر است و می تواند توسط WGS شناسایی شود. همچنین می توان با استفاده از sgRNA های اختصاصی تر از جهش های ناخواسته جلوگیری کرد. چند روش در منابع برای پیش‌بینی مکان‌های خارج از هدف در گیاهان یافت می‌شود. ابزارهای مختلف بیوانفورماتیک برای طراحی sgRNA های بسیار اختتصاصی با حداقل فعالیت خارج از هدف معرفی شده اند. یکی از ابزارهای اصلی پیش‌بینی جهش‌های خارج از هدف در گیاهان، CRISPR-PLANT v2 است. این نرم‌افزار بیشترین حساسیت را در بین تمام ابزارهای پیش‌بینی خارج از هدف نشان داد و در هفت ژنوم گیاهی از جمله Arabidopsis thaliana، Brachypodium distachyon، Oryza sativa، Medicago truncatula، Glycine max، Solanum lycopersicum و Sorghum bicolor قابل استفاده است. چندین روش برای تشخیص جهش ناخواسته، از جمله توالی یابی و نرم افزار پیش بینی آنلاین، در یوکاریوت ها معرفی شده است. به طور کلی، مطالعات بیشتری برای توسعه یک سیستم پیش‌بینی دقیق جهش های ناخواسته در گیاهان ضروری است.استراتژی های کاهش جهش های ناخواسته
خصوصیات sgRNA
سیستم CRISPR/Cas9 برای اهداف مختلفی مانند از دست دادن بیان ژن (knock-out)، بیان یک ژن جدید (knock-in) و افزایش یا کاهش بیان یک ژن مورد علاقه استفاده شده است. سیستم CRISPR/Cas9 با موفقیت در گیاهان مختلف از جمله برنج، گوجه فرنگی، آرابیدوپسیس، ذرت، صنوبر، انگور، خیار و گل اطلسی استفاده شده است. پیش‌بینی و اجتناب از جهش‌های خارج از هدف برای تجزیه و تحلیل ژنوم عملکردی، به ویژه در اصلاح گیاهانی که توالی کل ژنوم هنوز وجود ندارد، ضروری است. مطالعات بر روی CRISPR/Cas9 در گیاهان نشان داده است که مهم ترین نکته در افزایش جهش زایی هدف، طراحی sgRNA بسیار اختصاصی است. جهش زایی ناخواسته می تواند به دلیل شباهت sgRNA به مکان های ناخواسته رخ دهد. بنابراین، برای به حداقل رساندن جهش های خارج از هدف، اجتناب از استفاده sgRNA های حاوی توالی هسته ای هومولوگ با بسیاری از مکان های ژنومی دیگر است. sgRNA های با دقت طراحی شده می توانند هدف گیری خاص را تسهیل کنند حتی اگر مکان های همولوگ زیادی در ژنوم مورد مطالعه وجود داشته باشد. محتوای GC توالی هدف بالاتر از 70٪ نیز ممکن است جهش ناخواستته را افزایش دهد. مشخص شده است که محتوای GC توالی هدف بین 65-80٪ می تواند جهش های غیرمنتظره را افزایش دهد. با این حال، sgRNA هایی با محتوای GC بیشتر از 50 درصد به اندازه کافی برای افزایش جهش زایی در هدف به دلیل اتصال قوی به مکان های هدف کارآمد هستند. همچنین مشخص شده است که sgRNA با طول تا 17 نوکلئوتید (16 و 17 جفت باز) و بیش از 17 نوکلئوتید (18 و 20 جفت باز) به ترتیب کارایی ویرایش ژنوم کم و بالاتر را نشان داده اند. هیچ جهش ناخواسته ای را با استفاده از sgRNA باطول 20 جفت باز مشاهده نکردند. استفاده از sgRNA های متعدد برای یک ژن هدف، میزان جهش را در گیاهان برنج و گوجه فرنگی افزایش داده است. sgRNA ایده آل منجر به حداکثر جهش زایی در هدف و حداقل جهش زایی خارج از هدف می شود. به طور کلی، فراوانی جهش های خارج از هدف در گیاهان کمتر از فراوانی جهش های سوماتیک در طی کشت بافت گیاهی است، زیرا امکان به حداقل رساندن فراوانی تغییرات ناخواسته در سیستم کریسپر وجود دارد.غلظت sgRNA/Cas9
استراتژی دیگر برای کاهش جهش های ناخواسته، غلظت کم کمپلکس sgRNA/Cas9 است.. بنابراین انتخاب پروموترها برای کنترل بیان Cas9 ضروری است. در آرابیدوپسیس، Cas9 تحت کنترل پروموتر سازنده CaMV35S فراوانی ویرایش پایینی را در مقایسه با Cas9 تحت کنترل یک پروموتر خاص سلول تخم (ECS) نشان داد. این می تواند به دلیل بیان قوی تر Cas9 با استفاده از پروموتر ECS در مقایسه با CaMV35S باشد که باعث کارایی بالای سیستم ویرایش ژنوم CRISPR/Cas9 در گیاهان آزمایش شده می شود. بر اساس نتایج سایر مطالعات، سطح بالای sgRNA منجر به پتانسیل ویرایش پایین سیستم CRISPR/Cas9 در گوجه فرنگی و آرابیدوپسیس شد. تعدادی از مطالعات برای افزایش وراثت پذیری جهش ها با استفاده از پروموترهای خاص نیز انجام شده است. آنها گزارش دادند که استفاده از پروموترهای خاص مریستم مانند CLAVATA3، APETARA1 و INCURVATA2 می تواند منجر به افزایش وراثت پذیری و کارایی جهش شود. درگیاهان برنج T1 حاوی هر دو جز Cas9 و sgRNA ، جهش های ناخواسته را نشان دادند، در حالیکه جهش های ناخواسته در گیاهان حامل تنها یکی از این ژن ها مشاهده نشد. می توان نتیجه گرفت که با انتخاب گیاهان T1 مناسب که اجزای CRISPR در آنها جدا شده اند، می توان از جهش های خارج از هدف جلوگیری کرد.انواع مختلف Cas
دو ابزار مرسوم ویرایش ژنوم در گیاهان، سیستم‌های CRISPR/Cas9 و Cas12a (Cpf1) هستند. تفاوت عمده بین این دو نوکلئاز به شرح زیر است: اول اینکه Cas12a و Cas9 به ترتیب TTTV (V=A، C یا G) و NGG را تشخیص می دهند، و دوم اینکه Cas12a فقط به crRNA (بدون tracrRNA) نیاز دارد. لی و همکاران (2018) کارایی این نوکلئازها را در گیاهان ذرت بررسی کردند. نتایج آنها نشان داد که سیستم CRISPR/Cas9 کارآمدتر و اختصاصی‌تر از Cpf1 است. انواع طبیعی دیگری از Cas9 به نام‌های SaCas9 و StCas9 وجود دارد که توالی‌های PAM طولانی‌تری را نسبت به SpCas9 تشخیص می‌دهند، از جمله NNGRRT و NNAGAAW. محققین نشان دادند که با استفاده از SaCas9 جهش زایی هدفمند با کارایی بسیار بالاتری در مقایسه با استفاده از SpCas9 در آرابیدوپسیس حاصل می شود. بنابراین، می توان از آنها برای افزایش جهش زایی خاص و کاهش جهش ناخواسته نیز استفاده کرد. دو نسخه تغییر یافته از SpCas9 به نام‌های SpCas9-VQR و SpCas9-EQR برای شناسایی اهداف غیر معمول در آرابیدوپسیس استفاده شده است.SpCas9-VQR و SpCas9-EQR به ترتیب NGAN یا NGNG و NGAG را به عنوان دنباله های PAM می شناسند. توانایی SpCas9-VQR و SpCas9-EQR برای از بین بردن ژن های CLAVATA 3 و ASYMMETRIC LEAVES 1نشان داده شده است. با توجه به نتایج آنها، sgRNA های بیشتری را می توان با استفاده از انواع SpCas9 در مقایسه با SpCas9 معمولی طراحی کرد، بنابراین، این سیستم توانایی کافی برای ویرایش ژنوم آرابیدوپسیس را نشان داد و می تواند برای شناسایی اهداف غیر معمول موثر باشد.آپتازیم بر محدودیت های CRISPR/Cas9 غلبه می کند
سیستم CRISPR/Cas9 دارای محدودیت‌های دیگری است که ممکن است بر کارایی آن تأثیر بگذارد. RNA پلیمراز II (Pol II) برای تولید gRNA در داخل بدن کافی نیست زیرا اصلاح رونوشت های اولیه sgRNA، از جمله capping 5'- و 3'-polyadenylation، کارایی sgRNA و ویرایش ژنوم را کاهش می دهد. به طور کلی، تولید sgRNA در داخل بدن با استفاده از RNA پلیمراز III (Pol III) رخ می دهد. پروموترهای U3 و U6 با موفقیت برای تولید مولکول‌های sgRNA در گیاهان مختلف استفاده ده اند. با این حال، پروموترهای U3 و U6 دارای معایبی هستند از جمله بیان دایمی sgRNA، و شروع رونویسی وابسته به وجود نوکلئوتیدهای G و A در شروع توالی هدف برای پروموترهای U6 و U3 . علاوه بر این، رونوشت های اولیه این پروموترها دارای دم پلی U هستند که ممکن است کارایی ویرایش ژنوم را کاهش دهد. بنابراین، معرفی فناوری جدید برای جلوگیری از اصلاح مولکول sgRNA ممکن است کارایی سیستم CRISPR را افزایش دهد. محققین یک استراتژی sgRNA مبتنی بر ریبوزایم را برای غلبه بر این محدودیت ها معرفی کرد. آنها یک sgRNA مصنوعی (RGR) در کنار ریبوزایم طراحی کردند. RGR را می توان تحت کنترل پروموترهای معمولی به دلیل فعالیت نوکلئازی آن مورد استفاده قرار داد، که برش هر گونه تغییراتی مانند پلی آدنیلاسیون را انجام می دهد. رعایت نکاتی در طراحی RGR ضروری است. اولا" محل برش ریبوزایم انتهای '5 و ریبوزایم انتهای '3 باید به ترتیب قبل از اولین نوکلئوتید و بعد از آخرین نوکلئوتید sgRNA باشد و دوما" ویژگی های ریبوزایم در استراتژی RGR مهم هستند. ریبوزایم سر چکشی HHR)) با طول کمتر از 50 جفت باز و حاوی 6 جفت باز مکمل معکوس به 6 جفت باز اول sgRNA می تواند در انتهای '5 از RGR استفاده شود. ریبوزایم ذکر شده همچنین ممکن است در انتهای '3 از RGR استفاده شود.
بیش از 30 سال پیش، برخی از مولکول‌های کوچک RNA کشف و ریبوزایم نامیده شد. یک ریبوزایم به عنوان یک داربست مولکولی برای جداسازی محل اتصال ریبوزوم (RBS) عمل می کند. می تواند در ویرایش ژنوم مفید باشد. ریبوزایم سر چکشی از یک مارپیچ درون مولکولی (مارپیچ II) و دو مارپیچ بین مولکولی (مارپیچ I و III) تشکیل شده است. نواحی تک رشته ای کاملاً حفاظت شده و حاوی نوکلئوتیدهای خاصی برای فعالیت کاتالیزوری بهینه هستند. برخی از ریبوزیم‌ها وابسته به لیگاند هستند و به دانشمندان کمک می‌کنند تا بیان ژن‌های هدف را کنترل کنند. اولین بار، تانگ و بریکر (1997) آپتامر اتصال دهنده ATP را به حلقه-ساقه II از HHR ادغام کردند که منجر به طراحی یک ریبوزایم آلوستریک به نام آپتازایم شد. سپس، چن و همکاران (2018) موثرترین روش را برای کاهش جهش های ناخواسته با استفاده از یک آپتازایم (AZ، یک ریبوزایم خود شکافنده) معرفی کرد. آنها برای کنترل بیان Cas9 در حضور تئوفیلین، یک آپتازیم وابسته به تئوفیلین را به جای تترالوپ در ساختار Cas9/sgRNA وارد کردند. در این روش از تنظیم پس رونویسی برای فعالیت sgRNA استفاده شده است. قرار دادن AZ در تترالوپ و حلقه-ساقه II از sgRNA می تواند کارایی بیشتری در کنترل فعالیت sgRNA نسبت به وارد کردن AZ فقط در تترالوپ یا حلقه-ساقه II از sgRNA به دست آورد. درج مذکور بر جهش هدف تأثیری نداشت و افزودن تئوفیلین به کشت سلولی پس از 48 ساعت منجر به برش sgRNA و پایان ویرایش ژنوم شد. این رویکرد ساده و قابل اعتماد است و همچنین ممکن است برای کاهش اثرات جهش ناخواسته در گیاهان مفید باشد. رویکرد فوق می تواند برای کاهش جهش های ناخواسته سیستم CRISPR/Cas9 با اتصال آپتامر مناسب به HHR و طراحی آپتازایم کارآمد مورد استفاده قرار گیرد. تئوفیلین به طور طبیعی در گیاهان وجود دارد. بنابراین، آپتازیم وابسته به تئوفیلین را نمی توان در گیاهان استفاده کرد. تحقیقات بیشتری برای طراحی آپتازیم کارآمد با لیگاندی که به طور طبیعی در گیاهان وجود ندارد، مورد نیاز است.
