مترجم: حبیب الله علیخانی
منبع:راسخون
منبع:راسخون
جداسازی سلول های زنده و مرده ی مخمر یکی از روش های تشخیصی برای بیماری ها در مراحل اولیه و آزمایش مؤثر غربال گری دارویی و ... می باشد. این کار نشاندهنده ی یک روش میکروسیالی جدید برای جداسازی دی الکتروفورز سلول های مخمر زنده از سلول های مرده می باشد. این کار با الکتروفورز سلولهایی انجام می شود که در واقع الکتروفورز سلولی بوسیله ی میدان گرادیان میدان الکتریکی ذاتی در اتصال میکروکانال با بخش ذخیره سازی، انجام می شود و بدین وسیله، سلول های مخمر مرده، به صورت انتخابی، به دام می افتند. این کار موجب جداسازی سلول های زنده و ورود آنها به داخل منبع می شود. بنابراین، این روش روش دی الکتروفورزیز مبتنی بر مخزن(rDEP) نامیده می شود. این روش نسبت به سایر روش های دی الکتروفورز، مزیت دارد مثلا اشغال نشدن فضای کانال و حذف هر بخش مکانیکی یا الکتریکی در داخل میکروکانال ها. یک دستگاه rDEP می تواند به سهولت با سایر اجزای ترکیب شود و برای کاربردهای تشخیصی و درمانی بیولوژیکی، مورد استفاده قرار گیرد.
زنده ماندن سلولی، یکی دیگر از ویژگی های ذاتی است که برای جدایش سلول های بدون برچسب مورد استفاده قرار می گیرند. طبقه بندی سلول های زنده و مرده، برای تشخیص بیماری ها در مراحل اولیه مهم می باشد و همچنین بر روی میزان اثربخشی آزمون های مربوط به غربال گری دارویی و ... مورد استفاده قرار می گیرد. مطالعات قبلی بر روی این جداسازی در اصل، بر اساس دی الکتروفورز (DEP) انجام می شود که در واقع انتقال سلول ها، به سمت ناحیه ی میدان الکتریکی بزرگ و یا حرکت به سمت خارج از این میدان است. قابلیت پلاریزاسیون یک سلول، به خواص الکتریکی (رسانایی و گذردهی)، خواص مکانیکی (اندازه و شکل) و فرکانس میدان الکتریکی، وابسته است. این مسئله ما را قادر می سازد تا جداسازی را بدون استفاده از برچسب انجام دهیم. این کار از طریق یک یا چند خاصیت و از طریق DEP انجام می شود. این گزارش داده شده است که وقتی این سلول ها می میرند، دارای رسانایی کمتری در هسته و رسانایی بیستری در غشای خود هستند. بنابراین، پاسخ دی الکتریک سلول های زنده و مرده می تواند متفاوت باشد، مخصوصاً تحت میدان های الکتریکی AC با فرکانس بالا.
جداسازی میکروسیال مبتنی بر DEP که برای سلول های مرده و زنده، مورد استفاده قرار می گیرند، با استفاده از سه روش انجام می شود. اولین روش، روش دی الکتروفورز بر پایه ی الکترود (eDEP) است که در آن فرکانس میدان AC در میکروالکترودهای تعبیه شده در کانال، ایجاد می شود و بدین صورت، پاسخ دی الکتروفورز متمایزی از سلول های مرده و سلول های زنده، بدست می آید. نتیجه، حفظ گزینشی یک نوع از سلول در داخل میدان و خروج سلول دیگر، از این ناحیه می باشد. در واقع یک نوع از این سلول ها، از محیط شسته می شود و یا به داخل یک محیط دیگر مهاجرت می کند. این روش جداسازی eDEP همچنین می تواند سلول های مرده و زنده را به مسیرهای جریانی مختلف هدایت کند. در واقع این مسیرهای مجزا را می توان به بخش های ذخیره سازی مجزا هدایت کرد. روش دوم برای جداسازی دی الکتروفورز سلول های زنده و مرده، روش دی الکتروفورز مبتنی بر عایق کننده (iDEP) است که در آن یک آرایه از بخش های عایق بر روی دیواره ی میکروکانال ایجاد می شوند و میدان الکتریکی اعمال شده، در این بخش ها، تغییر می کند. به دلیل پاسخ های متفاوت دی الکتروفورز، سلول های زنده و مرده می توانند د داخل نواحی مختلف، به دام افتند یا تنها یک نوع از سلول ها، به صورت انتخابی یا گزینشی بر روی عایق باقی بمانند. روش سوم جداسازی DEP برای سلول های زنده و مرده، دی الکتروفورز بدون تماس (cDEP) است. که در آن الکترودها به صورت فیزیکی از نمونه جدا می شوند. این کار از طریق یک عایق انجام می شود و گرادیان های میدان الکتریکی، عمدتا به شکاف های کوچکی محدود می شود که میان میکروکانال های اصلی و فرعی وجود دارند. تحت میدات الکتریکی AC و اعمال فرکانس مناسب، سلول های زنده می تواند به صورت انتخابی بوسیله ی DEP مثبت به دام افتند در حالی که سلول های مرده می توانند از ناحیه ی به دام افتادن، عبور کنند.
ما در این باره، یک روش جدید میکروسیال برای جداسازی دی الکتروفورز سلول ها بر اساس زنده بودن سلولی، توسعه داده ایم. ما از روش دی الکتروفورز مبتنی بر ذخیره (rDEP) استفاده کرده ایم که در آن گرادیان های میدان الکتریکی ذاتی در اتصال بخش ذخیره سازی- میکروکانال، ایجاد می شود و بدین وسیله، سلول های مرده ی مخمری به صورت گزینشی به دام می افتند. در این حالت جداسازی به صورت پیوسته انجام می شود و سلول های زنده وارد بخش ذخیره سازی می شود. در مقایسه با روش های دی الکتروفورز موجود، روش ما بر اساس بخش های مکانیکی یا الکتریکی درداخل میکروکانال، کار نمی کنند. این مسئله موجب می شود تا نه تنها، ساخت وسیله و کنترل آن، تسهیل شود و همچنین موجب می شود تا موارد آسیب زننده مانند واکنش های الکتروشیمیایی بر روی سطح میکروالکترودها، انجام نشود. ما به دام افتادن با روش rDEP و جدایش سلول های زنده و مرده ی مخمر را با استفاده از روش های عددی و تجربی، بررسی کردیم.
میکروکانال از جنس پلی دی متیل سیلوکسان (PDMS) و با استفاده از روش لیتوگرافی استاندارد(SU 8-25, MicroChem, Newton, MA)، تولید می شوند. به طور خاص، از روش فوتورسیت بر روی اسلایدهای شیشه ای تمیز، استفاده می شود و بر روی این بخش، یک سرعت زاویه ای در حد 2000 RPM ایجاد می شود.. فیلم فوتورسیست ایجاد شده، که دارای ضخامت 25 میکرون است، در دستگاه هات پلیت دیجیتال نرم می شود. این کار در دو مرحله، یکی در دمای 65 درجه ی سانتیگراد به مدت 3 دقیقه و دیگری در دمای 95 درجه به مدت 7 دقیقه، انجام می شود. این فیلم سپس تحت تابش نور UV قرار می گیرد. با این روش یک ماسک منفی با الگوهای میکرکانالی ایجاد می شود. بعد از مرحله ی سخت سازی دو مرحله ی در دماهای 65 درجه به مدت 1 دقیقه و دمای 95 درجه به مدت 3 دقیقه، فوتورسیست عمل آوری شده، در محلول توسعه ی SU-8 ایجاد می شود. این کار در زمانی برابر با 4 دقیقه، انجام می شود. نتیجه ی حاصله یک نسخه ی دقیقق از میکروکانال ها بر روی اسلاید شیشه ای است. بعد از شستشوی اندک در ایزوپروپیل الکل و پخت در دمای 150 دقیقه به مدت 5 دقیقه، فوتورسیست برای استفاده به عنوان قالب میکروکانال، آماده است.
بعد از آن، یک مخلوط با نسبت 10 به 1 از پیش ماده ی پلیمری و عامل عمل آوری PDMS (الاستومر سیلیکونی 184 Sylgrad)، آماده می شود و به داخل قالب میکروکانال وارد می شود. بعد از 30 دقیقه گازگیری در یک آون خلأ هم دما ، PDMS مایع در دمای 70 درجه در یک آون معمولی به مدت 2 ساعت، عمل آوری می شود. ریزساختار میکروکانال با استفاده از چاقوی کوچک جراحی بریده می شود و از قالب جداسازی می شود. دو حفره در دو انتهای کانال ایجاد می شود که در آزمایش، به عنوان منبع عمل می کنند. دیواره ی کانال PDMS سپس با استفاده از پلاسما، به مدت 1 دقیقه، عمل آوری می شود. در نهایت، دو سطح عمل آوری شده، به همدیگر می چسبند و میکروکانال را تشکیل می دهند.
شکل 1 نشاندهنده ی تصویری از یک وسیله ی میکروسیال PDMS- شیشه است که به همین شیوه، تولید شده است. این گفته شده است که طول میکروکانال حاصله، 3.3 میلی متر و قطر منبع برابر با 5 میلی متر می باشد. کانال حاصله 500 میکرون عرض دارد و بخش تنگ آن، 35 میکرون عرض دارد. این سطح با مقطع کوچکتر، به منظور کاهش در پتانسل الکتریکی مورد نیاز و افزایش میدان الکتریکی، ایجاد شده است. کانال به طور یکنواخت دارای عمق 25 میکرون است و شعاع ثابت آن برای تمام گوشه ها، 20 میکرون است.
به دلیل عدم تطابق قابل توجه میان قطر منبع (5 میلی متر) و قطر میکروکانال (35 میکرون)، میدان الکتریکی به طور ذاتی در نواحی ساختاری، غیر یکنواخت می گردد. این مسئله با میدان شمار، مورد تأیید قرار گرفته است. شکل 2 نششاندهنده ی توالی مربوط به سطح مشترک حرکت دی الکتروفورز القا شده (U_DEP) می باشد این توالی در زمانی ایجاد می شود که سلول ها به صورت الکتروکینتیکی، از داخل سطح مشترک ماکرو- میکرو، عبور می کنند. این حرکت سپس rDEP نامیده می شود. با استفاده از تخمین ممنتوم نقطه ی دوقطبی،متوسط زمانی مربوطه به U_DEP یک سلول سلب کروی، به صورت زیر بدست می آید:
در معادله ی بالا، μ_DEP موبیلیته ی دی الکتروفورز سلول ها، E_RMS میدان الکتریکی محلی در مقدار RMS، r شعاع سلول، ε_f ثابت دی الکتریک سیال، η_f ویسکوزیته ی دینامیک سیال، Re{f_CM } بخش حقیقی فاکتور مختلط کلازیوس- موساتی (CM) است (f_CM) و ε^*=ε-iσ/w ثابت دی الکتریک موهومی و i عدد موهومی، σ رسانایی الکتریکی و w فرکانس میدان است. زیربند c در معادله ی سوم نشاندهنده ی سلول و f نشاندهنده ی سیال است.
ثابت دی الکتریک مختلط سلول های زنده و مرده ی مخمر می تواند با استفاده از مدلی محاسبه شود که به آن، مدل چند پوسته ای، می گویند. در این مدل، این در نظر گرفته می شود که سلول ها سه لایه ی هم مرکز با خواص دی الکتریک مختلف دارند. جزئیات مربوط به این مدل، و پارامترهای مربوطه، در پیوست آروده شده است. شکل 3 فاکتور CM پیش بینی شده بوسیله ی مدل را برای دو نوع از این سلول ها را مورد بررسی قرار می دهد. این سلول ها در داخل بافر فسفاتی یک میلی مولار رقیق سازی شده اند. در این شکل، فاکتور CM نسبت به تغییر در فرکانس میدان AC ترسیم شده است. به دلیل اختلاف های موجود در رسانایی الکتریکی غشاء سلولی و سیتوپلاسم، سلول های زنده و مرده ی مخمر نسبت به میدان AC پاسخی متفاوت دارند. در گستره ی یک میدان DC خالص (یعنی فرکانس صفر) و یک میدان AC با فرکانس500kHz، هر دو نوع سلول دارای فاکتور CM منفی هستند و از این رو، DEP منفی دریافت می کنند (به بخش های خط تیره دار در شکل 3 توجه کنید، که بوسیله ی آنها، نمودار به دو قسمت مثبت و منفی تقسیم شده است). برای میدان های AC با فرکانس کمتر از 100kHz، سلول های زنده ی مخمر، rDEP قوی تری نسبت به سلول های مرده، دریافت می کنند (یعنی فاکتور CM آنها دارای مقداری بزرگ است). در فرکانس حدود 200 kHz،پاسخ DEP در دو نوع سلول، قابل مقایسه می شود و تفاوت نسبی آنها حفظ شده است. برای فرکانس های بالاتر از 300kHz (و کمتر از 500 kHz)، سلول های مرده، rDEP منفی تری نسبت به سلول های زنده، دریافت می کنند.
سرعت مشاهده شده برای سلول (U_c)در اتصال منبع- میکروکانال، بردار اضافه شده ب هسرعت الکتروکینتیکی DC سلول می باشد. U_EKو سرعت های دی الکتروفورز (U_DEP) به صورت زیر محاسبه می شود:
که در اینجا، μ_EK موبیلیته ی الکتروکینتیکی سلول است که می تواند به صورت تجربی و با ردیابی سلول های منفرد در میدان های الکتریکی خالص DC محاسبه شوند. توجه کنید که حرکت های ناشی شده از اینرسی، حرکت برونی و جاذبه ی زمین، در معادله ی چهارم صرفنظر شده است. مشابه با آنچه ما قبلا انجام داده ایم، سرعت سلول (U_c) می تواند به صورت زیر بازنویسی شود:
<
که در اینجا، U_EK بزرگی سرعت الکتروکینتیکی جریان، U_(DEP,s) مقدار سرعت سلولی دی الکتروفورز، s ̂ بردار واحد مختصات S در طول جریان، U_(DEP,n)مقدار سرعت دی الکتروفورز جریان عرضی، n ̂ بردار واحد مربوط به مختصات عمود بر خط جریان و R شعاع محلی نمودار خط جریان می باشد.
در آزمایش های ما، فرکانس میدان الکتریکی AC کمتر از 500 kHz در نظر گرفته می شود تا بدین صورت، اطمینان حاصل شود که در اتصال منبع- میکروکانال، rDEP برای هر دو نوع سلول مرده و زنده، منفی باشد (شکل 3). بنابراین، U_(DEP,n) به سمت خط مرکزی کانال هدایت می شود (تجزیه و تحلیل مربوط به سرعت در شکل 1 را ببینید). این مورد موجب ایجاد اثر متمرکز کننده بر روی سسلول های معلق در داخل اتصال منبع- میکروکانال می شود. در این میان، U_(DEP,s) مخالف U_EK است و بنابراین، موجب کاهش سرعت تمام سلول ها در محل اتصال می شود (شکل 1). علاوه بر این، از آنجایی که U_(DEP,s)در میدان های AC و DC ، یک تابع درجه دو است و U_EK تنها به صورت خطی با میدان DC در ارتباط است، این فهمیده شده است که U_(DEP,s) می تواند موجب تعادل در U_EK شود. این مسئله زمانی رخ می دهد کهE_DC یا E_AC افزایش می یابد. در این نقطه و خارج از ان، سرعت سلول ها، کاهش می یابد و سلول ها می توانند در جلوی اتصال ذخیره- میکروکانال، ساکن شوند. یعنی
یا
که در اینجا،نسبت RMS میدان AC به DC است. توجه کنید که برای DEP سلولی منفی، است. مقدار مورد نیاز برای α در سلول های به دام افتاده، تابعی از دو نسبت موبیلیته ی سلولی است: یکی نسبت موبیلیته ی سلولی الکتروکینتیکی DC ( )و دیگری موبیلیته ی الکتروفورز DC ( )است. این دو کمیت بدون بعد هستند. بنابراین، ما می توانیم به طور بالقوه یک نوع از سلول ها را به دام بیندازیم یا غلظت سلول های یک نوع را افزایش دهیم.
مدل سازی های عددی
شبیه سازی مربوط به حرکت الکتروکینتیکی سلول از منبع به میکروکانال، در نرم افزار COMSOL 3.5a انجام شده است. این کار به صورت مدل سازی دو بعدی، انجام شده است این مدل از حرکت های چرخشی ایجاد شده در سیال، صرفنظر کرده است. به جای آن، یک فاکتور تصحیح (λ_c) برای اثرات اندازه ی سلول بر روی سرعت دی الکتروفورز سلول ها، در نظر گرفته شده است. به همین نحو، سرعت سلول در معادله ی چهارم به صورت زیر بازنویسی شده است:
توزیع میدان الکتریکی، با حل معادله ی لاپلاس ، بدست می آید. همچنین پتانسیل الکتریکی DC (ϕ_DC) به صورت عملی اعمال می شود. الکترود موجود در هر مخزن بوسیله ی یک مدار هم محور با قطر 0.5 میلی متر، شبیه سازی می شود و بوسیله ی آن، یک پتانسیل الکتریکی اعمال می شود. مخصوصاً ولتاژ DC اعمال شده، بوسیله ی الکترودی ایجاد می شود که در کل مخزن قرار دارد. الکترود موجود در مخزن به زمین متصل شد. فرض شده است که تمام دیواره های میکروکانال، از لحاظ الکتریکی عایق است.
سرعت سلول در معادله ی هفتم به عنوان ورودی برای تابع ردیابی ذره در COMSOL 3.5a مورد استفاده قرار گرفت. موبیلیته ی الکتروکینتیکی (μ_EK) با ردیابی حرکت سلول های منفرد در بدنه ی میکروکانال، محاسبه گردید. این موبیلیته برای سلول های مخمر زنده و مرده، برابر با می باشد. موبیلیته ی دی الکتروفورز با استفاده از معادله ی دوم و با در نظر گرفتن ویسکوزیته ی دینامیک و ثابت دی الکتریک بدست می آید (این اطلاعات برای آب خالص در دمای 20 درجه انجام می شود). یک کد متلب برای محاسبه ی فاکتورهای CM در فرکانس های مختلف میدان الکتریکی، نوشته شد. این کد بر اساس مدل چند پوسته ای نوشته شد. فاکتور تصحیح (λ_c)برای هر دو نوع سلول برابر با 0.5 در نظر گرفته شد که نحوه ی محاسبه در مطالعه ی قبلی ما گفته شده است.
نتایج وبحث
افزایش غلظت و به دام افتادن سلول های مخمر زنده با rDEP
تصاویر پیوست ی مربوط به این پدیده، در شکل 4 نشان داده شده است. این شکل نشاندهنده ی رفتارهای نمونه وار حرکت سلولی الکتروکینتیکی در داخل اتصال مخزن- میکروکانال، تحت میدان الکتریکی AC بایاس شده با DC است. سلول های مخمر زنده برای این نمایش، مورد استفاده قرار گرفته اند. ولتاژ DC اعمال شده، در سطح 2V حفظ شد تا بتوان ولتاژ DC برابر با 6 v/cm را در سطح طول میکروکانال ایجاد کرد. ولتاژAC اعمال شده (مقدار RMS) در فرکانس 1kHz ثابت نگه داشته شد در حالی که مقدار ولتاژ از صفر ( یعنی نسبت ولتاژ AC به DC برابر با صفر) تا 30 ولت (یعنی نسبت ولتاژ AC به DC برابر با 15) و ولتاژ 50 ولت (یعنی نسبت ولتاژ AC به DC برابر با 25) متغیر است. تحت میدان DC مطلق، سلول از میان اتصال منبع- ذخیره، به صورت یکنواخت توزیع شده است (شکل 4a). این مسئله به دلیل rDEP ناچیزی است که در اتصال و تحت میدان DC ایجاد شده است.
به هر حال، با استفاده از ولتاژ AC برابر با 30 ولت، غلظت سلول ها، افزایش می یابد که علت آن، rDEP می باشد. مشاهدات شکل 4b مطابق با بررسی های قبلی بر روی حرکت ذرات پلیمری در اتصال منبع- میکروکانال است. وقتی ولتاژ AC به 50 ولت افزایش می یابد، سلول ها به دام می افتند و غلظت آنها در منبع افزایش می یابد (شکل 4c). منحنی های پیش بینی سلولی در شرایط تجربی مربوطه، همچنین در شکل 4 نشان داده شده است. یک تطابق نزدیک برای تمام سه مورد بحث شده در بالا، بدست آمده است. در طی آزمایش، اثرات حرارت دهی ژول نیز قابل توجه نبوده است، حتی در بزرگترین میدان الکتریکی اعمال شده. این مسئله بوسیله ی ارزیابی جریان الکتریکی در هر آزمایش، مورد تأیید قرار گرفت.
مقایسه ی rDEP در به دام انداختن سلول های مخمر زنده و مرده
ما به دام افتادن rDEP سلول های مخمر زنده را تحت میدان های الکتریکی AC بایاس شده با DC در گستره ی فرکانس 1 تا 500 kHZ مورد ارزیابی قرار دادیم. ولتاژ DC در طی کل اندازه گیری، 2 ولت ثابت شد. نسبت ولتاژ AC به DC (α) برای یک به دام افتادن سلولی پایدار، که در اتصال منبع- میکروکانال اتفاق می افتد، در شکل 5a نشان داده شده است. این نسبت ولتاژی نسبت به فرکانس میدانی AC می باشد. به دلیل کاهش در مقدار فاکتور CM با افزایش فرکانس (شکل 3)، سلول ها باید یک rDEP ضعیف تری را در هنگام افزایش فرکانس، تجربه کند. این مسئله مخصوصاً وقتی رخ می دهد که فرکانس بیش از 100 kHz است. این مسئله توضیح می دهد که چرا نسبت ولتاژ AC به DC اندازه گیری شده، با افزایش فرکانس (شکل 5a) رویه ای دارد که مشابه با رویه ی پیش بینی شده می باشد. ما همچنین به دام افتادن سلول های مخمر مرده را با رویه ای مشابه بدست آوردیم. داده های تجربی و پیش بینی های عددی مربوطه، در شکل 5b نشان داده شده است. یک رویه ی مشابه برای سلول های مرده و زنده، مشاهده شده است.
به هر حال، نسبت ولتاژ AC به DC برای به دام افتادن سلول های مخمر زنده، بزرگتر از این نسبت برای به دام افتادن سلول های مرده می باشد. این مسئله در کل گسترده ی فرکانس مورد مطالعه، مشاهده شده است. این مسئله در شکل 6 بهتر دیده می شود. در این شکل، نسبت برای هر دو نوع سلول اندازه گیری شده است (شکل 3). در واقع، سلول های مخمر زنده، یک کاهش قابل توجه در میزان rDEP را نسبت به سلول های مرده دریافت می کنند. این مسئله زمانی مشاهده می شود که فرکانس میدان AC تغییر می کند و بنابراین، مورد آخر، متحمل حرکت های الکتروکینتیکی بزرگتری می شوند. علاوه بر این، وقتی این سلول ها، متحمل حرکت های الکتروکینتیکی سریع تر می شوند، سلول های مخمر زنده، باید نسبت موبیلیته ی الکتروکینتیکی به دی الکتروفورز بزرگتری نسبت به سلول های مرده، دریافت می کند. ناهمخوانی در دو نسبت به طور متقابل، توضیح می دهد که چرا سلول های مخمر مرده، می توانند به سادگی به دام افتند.
شکل 6 می تواند به عنوان دیاگرام فازی برای دستکاری الکتریکی سلول های زنده و مرده در اتصال منبع- میکروکانال (با استفاده از rDEP) مورد استفاده قرار گیرد. نمودار نسبت میدان AC به DC برای دو نوع سلول، به سه ناحیه تقسیم می شود (نواحی 1 تا 3 که در شکل 6 علامت زده شده است). در ناحیه ی 1، نسبت میدان AC به DC برای به دام انداخته سلول های زنده، بزرگتر است و از این رو، هم سلول های مرده و هم زنده می توانند به دام افتند (cf در شکل 4b). به طور عکس، ناحیه ی 3 دارای نسبت AC به DC کوچکتر است و از این رو، تنها سلول های مخمر مرده به دام می افتند. همچنین، rDEP ایجاد شده، تنها قادر است تا دو نوع سلول را در مرکز صفحه ی مربوط به میکروکانال، متمرکز کند (cf در شکل 4b).در ناحیه ی 2، یعنی ناحیه ای که در شکل 6، هایلایت شده است، نسبت میدان AC به DC بین دو مقداری است که به ترتیب، برای بدام افتادن سلول های زنده و مرده ، مورد نیاز است.
بنابراین، سلول های مخمر مرده، به دام می افتند و غلظت آنها در داخل منبع، بیشتری می شود، در حالی که سلول های مخمر زنده، از میان میکروکانال می گذرند. البته این کار به دو شیوه انجام می شود. یکی آنکه با استفاده از فرکانس میدان AC و دیگری با استفادهل از ثابت نگه داشتن نسبت میدان AC به DC.
از لحاظ فنی، جداسازی rDEP مربوط به سلول های مخمر زنده و مرده در محل اتصال منبع- میکروکانال، می تواند با استفاده از تنظیم نسبت میدان های AC به DC در کل ناحیه ی 2 از شکل 6 انجام شود. به هر حال، از لحاظ فنی، ما نیازمند این هستیم تا یک زوج از فاکتورها را در نظر بگیریم. یکی از این فاکتور، فاصله ی میان میدان های AC به DC برای به دام افتادن سلول های زنده و مرده است که این فاصله، هر چه بیشتر باشد، بهتر است. این مسئله موجب می شود تا طراحی و کنترل وسیله، به نسبت، ساده شود. شکل 6 نشان دهنده ی این است که ما می توانیم از فرکانسی در گستره ی 1-100 kHz یا 300-400 kHz استفاده کنیم. فاکتور دوم، فرکانس میدان AC است که باید تا حد ممکنه پایین تر باشد. علت این مسئله، این است که میدان های AC بزرگتر را باید در فرکانس های بالاتر استفاده کرد که این مسئله موجب بروز دو مسئله می شود: 1) حرارت ژول و اثرات الکتروشیمیایی ممکن است موجب بروز اثرات نامطلوب بر روی نمونه و وسیله شود. و 2) انتخاب آمپلی فایرهای تجاری موجود به طور قابل توجهی به ولتاژ محدود می باشد.
با در نظر گرفتن این فاکتورها، ما جداسازی rDEP را به صورت عملی در میدان های AC بایاس شده با DC انجام دادیم که فرکانسی کمتر از 1 kHz دارند. این واضح است که استفاده از ولتاژ 47.5 V AC و بایاس 4 ولتی، می تواند یک غلظت گزینشی و جدایش پیوسته ای را در بین سلول های مخمر زنده و مرده، ایجاد کند. نتایج تجربی و عددی در شکل 7 نشان داده شده است. شکل 7a نشاندهنده ی یک تصویر لحظه ای از رفتار سلول ها در محل اتصال است که در آن سلول های مرده ی بدون برچسب فلئورسنت، در داخل منبع به دام می افتند در حالی که سلول های زنده ی حاوی برچسب فلئورسنت، وارد میکروکانال می شوند. تصویر خطی مربوط به سلول های زنده و مرده، در شکل 7b و 7c نشان داده شده است. بررسی آماری نشاندهنده ی تطابق مناسب میان نتایج عملی و تئوری است.
ما قبول داریم که این تحقیق تنها نشاندهنده ی جدایش پیوسته ی سلول های زنده و مرده از طریق rDEP است. چندین موضوع وجود دارد که نیازمند بررسی های دیگر می باشند و ممکن است نیازمند آدرس دهی باشند. یک موضوع خروجی سلولی پایین این روش است که به دلیل محدود بودن ولتاژ اعمال شده بوسیله ی آمپلی فایر توان بالا، ایجاد می شود. نرخ جریان تخمین زده شده در جدایش سلولی با این روش، در حدود 0.2 میکرو لیتر بر دقیقه است که به طور قابل توجهی پایین تر از روش های الکتروفورز بر پایه ی پمپ های هیدرودینامیکی، می باشد. به هر حال، این روش، مشابه روش هایی است که در آن، از میدان الکتریکی متحرک برای انتقال سلول های معلق، استفاده می شود. خروجی ممکن است با استفاده از آمپلی فایر ولتاژ بالا و یا استفاده از میکروکانال های باریک، افزایش یابد. البته این مسئله تا زمانی که نسبت میدان AC به DC به طور منتاسب انتخاب شود، بر روی میزان اثربخشی جدایش، اثری ندارد. موضوع دیگر، حرکت دینامیکی مشاهده شده برای سلول های مرده ی به دام افتاده ای است که وارد میکروکانال می شوند. این حرکت بر روی حرکت سلول های زنده ی به دام نیفتاده نیز اثر دارند. این مسئله در تصاویر 7b و 7c قابل مشاهده است. در این مورد، ناحیه ی مدوری در اتصال مخزن- میکروکانال ایجاد می شود که بوسیله ی هر کدام از سلول های بیان شده، ایجاد می شوند. یک چنین رفتاری، در مدل ارائه شده بوسیله ی ما، در نظرگرفته نشده است و از این برهمکنشها، صرفنظر شده است.
نتیجه گیری
ما یک روش جدید برای جداسازی پیوسته ی سلول های موجود در میکروکانال ها با استفاده از روش rDEP ارائه کرده ایم. انتقال، متمرکز شدن و به دام افتادن سلول های مرده و زنده ی مخمر در اتصال مخزن- میکروکانال، با تغییر ساده ای در میدان AC بایاس شده با میان DC، ایجاد شده است. این پدیده می تواند بوسیله ی مدل دو بعدی پیشنهاده شده بوسیله ی ما، توصیف گردد. ما همچنین مطالعه ی اساسی بر روی نسبت میدان AC به DC و در یک گسترده ی بزرگ، انجام دادیم که نتایج نشاندهنده ی تطابق خوب نتایج تجربی با نتایج شبیه سازی است. در فرکانس مورد بررسی، نسبت میدان AC به DC برای به دام افتادن سلول های مخمر زنده، بالاتر از نسبت مورد نیاز برای به دام افتادن سلول های مرده است. تفاوت در این نسبت، برای ایجاد غلظت های گزینشی و جدایش پیوسته ی سلول های مخمر مرده از سلول های زنده، در محل اتصال، منبع- میکروکانال، ضروری است. از آنجایی که جدایش سلولی در داخل منبع انجام می شود، مسئله ی رسوب گیری نیز ممکن است رخ دهد. که این روسبات باید جداسازی شود. علاوه بر این، کل میکروکانال می تواند مورد بررسی آنالیزهای ثانویه قرار گیرد و این دستگاه را می توان در آزمایشگاه، به همراه سایر دستگاه ها، استفاده کرد و از آن برای کاربردهای بیوپزشکی، بهره برد.
محاسبه ی ثابت دی الکتریک مربوط به سلول های زنده و مرده
پاسخ دی الکتروفورز مربوط به سلول های زنده و مرده، در میدان های الکتریکی، متفاوت است. یعنی فاکتور CM در معادله ی دوم با استفاده از یک مدل دو پوسته ای، قابل محاسبه است. همانگونه که به صورت آماری در شکل 8 قابل مشاهده است، یک سلول در این مدل، به عنوان یک پوسته ی دی الکتریک، در نظر گرفته می شود که بوسیله ی دو لایه ی هم محور پوشیده شده است. ثابت دی الکتریک مختلط یک چنین سلولی (ε_c^*) در معادله ی سوم، به صورت زیر محاسبه می شود:
در بالا، ε_1^*، ε_2^* و ε_3^* به ترتیب، ثابت دی الکتریک دیواره ی سلولی، غشاء و هیته است و به صورت زیر تعریف می شود: ε^*=ε-iσ/w. مقادیر مربوط به شعاع، رسانایی الکتریکی (σ) و ثابت دی الکتریک برای هر سه لایه در شکل 8 نشان داده شده است.
شکل 1
استفاده از مطالب این مقاله، با ذکر منبع راسخون، بلامانع می باشد.
مقدمه
جدایش سلولی، یک مرحله ی ضروری در تحقیقات بیولوژِیکی می باشد و کاربردهای مهمی در بسیاری از نواحی مانند ارزیابی محیطی، تولید غذا و صنعت داروسازی دارد. وسایل میکروسیال به طور روز افزون برای جداسازی سلول ها مورد استفاده قرار می گیرند. علت این استفاده، هزینه، دقت، اثربخشی و سایر مزیت های این روش نسبت به سایر روش های میکروسکوپی، می باشد. میدان های نیروی مختلفی برای جدایش سلول ها در میکروسیال ها، مشارکت دارند. این نیروها، عبارتند از نیروی گرانش، نیروی هیدرودینامیک، نیروی الکتریکی، نیروی صوتی، نور، نیروی مغناطیس، نیروی اینرسی و ... . این جدایش می تواند با و بدون استفاده از برچسب بیوشیمیایی خاص هر سلول، انجام شود.انتخاب کننده های سلولی (cell sorters) فلئورسنت و انتخاب کننده های فعال شده با مواد مغناطیسی، دو مثالی هستند که برای برچسب زنی خارجی سلول های هدف یا غیر هدف، مورد استفاده قرار می گیرند. برای جدایش سلول های بدون برچسب، بیومارکرهای ذاتی متعددی برای این منظور مورد استفاده قرار گرفته اند که در آنها، از خواصی همچون، اندازه، شکل، دانسیته، بار، تغییر شکل و سایر خواص، استفاده می شود.زنده ماندن سلولی، یکی دیگر از ویژگی های ذاتی است که برای جدایش سلول های بدون برچسب مورد استفاده قرار می گیرند. طبقه بندی سلول های زنده و مرده، برای تشخیص بیماری ها در مراحل اولیه مهم می باشد و همچنین بر روی میزان اثربخشی آزمون های مربوط به غربال گری دارویی و ... مورد استفاده قرار می گیرد. مطالعات قبلی بر روی این جداسازی در اصل، بر اساس دی الکتروفورز (DEP) انجام می شود که در واقع انتقال سلول ها، به سمت ناحیه ی میدان الکتریکی بزرگ و یا حرکت به سمت خارج از این میدان است. قابلیت پلاریزاسیون یک سلول، به خواص الکتریکی (رسانایی و گذردهی)، خواص مکانیکی (اندازه و شکل) و فرکانس میدان الکتریکی، وابسته است. این مسئله ما را قادر می سازد تا جداسازی را بدون استفاده از برچسب انجام دهیم. این کار از طریق یک یا چند خاصیت و از طریق DEP انجام می شود. این گزارش داده شده است که وقتی این سلول ها می میرند، دارای رسانایی کمتری در هسته و رسانایی بیستری در غشای خود هستند. بنابراین، پاسخ دی الکتریک سلول های زنده و مرده می تواند متفاوت باشد، مخصوصاً تحت میدان های الکتریکی AC با فرکانس بالا.
جداسازی میکروسیال مبتنی بر DEP که برای سلول های مرده و زنده، مورد استفاده قرار می گیرند، با استفاده از سه روش انجام می شود. اولین روش، روش دی الکتروفورز بر پایه ی الکترود (eDEP) است که در آن فرکانس میدان AC در میکروالکترودهای تعبیه شده در کانال، ایجاد می شود و بدین صورت، پاسخ دی الکتروفورز متمایزی از سلول های مرده و سلول های زنده، بدست می آید. نتیجه، حفظ گزینشی یک نوع از سلول در داخل میدان و خروج سلول دیگر، از این ناحیه می باشد. در واقع یک نوع از این سلول ها، از محیط شسته می شود و یا به داخل یک محیط دیگر مهاجرت می کند. این روش جداسازی eDEP همچنین می تواند سلول های مرده و زنده را به مسیرهای جریانی مختلف هدایت کند. در واقع این مسیرهای مجزا را می توان به بخش های ذخیره سازی مجزا هدایت کرد. روش دوم برای جداسازی دی الکتروفورز سلول های زنده و مرده، روش دی الکتروفورز مبتنی بر عایق کننده (iDEP) است که در آن یک آرایه از بخش های عایق بر روی دیواره ی میکروکانال ایجاد می شوند و میدان الکتریکی اعمال شده، در این بخش ها، تغییر می کند. به دلیل پاسخ های متفاوت دی الکتروفورز، سلول های زنده و مرده می توانند د داخل نواحی مختلف، به دام افتند یا تنها یک نوع از سلول ها، به صورت انتخابی یا گزینشی بر روی عایق باقی بمانند. روش سوم جداسازی DEP برای سلول های زنده و مرده، دی الکتروفورز بدون تماس (cDEP) است. که در آن الکترودها به صورت فیزیکی از نمونه جدا می شوند. این کار از طریق یک عایق انجام می شود و گرادیان های میدان الکتریکی، عمدتا به شکاف های کوچکی محدود می شود که میان میکروکانال های اصلی و فرعی وجود دارند. تحت میدات الکتریکی AC و اعمال فرکانس مناسب، سلول های زنده می تواند به صورت انتخابی بوسیله ی DEP مثبت به دام افتند در حالی که سلول های مرده می توانند از ناحیه ی به دام افتادن، عبور کنند.
ما در این باره، یک روش جدید میکروسیال برای جداسازی دی الکتروفورز سلول ها بر اساس زنده بودن سلولی، توسعه داده ایم. ما از روش دی الکتروفورز مبتنی بر ذخیره (rDEP) استفاده کرده ایم که در آن گرادیان های میدان الکتریکی ذاتی در اتصال بخش ذخیره سازی- میکروکانال، ایجاد می شود و بدین وسیله، سلول های مرده ی مخمری به صورت گزینشی به دام می افتند. در این حالت جداسازی به صورت پیوسته انجام می شود و سلول های زنده وارد بخش ذخیره سازی می شود. در مقایسه با روش های دی الکتروفورز موجود، روش ما بر اساس بخش های مکانیکی یا الکتریکی درداخل میکروکانال، کار نمی کنند. این مسئله موجب می شود تا نه تنها، ساخت وسیله و کنترل آن، تسهیل شود و همچنین موجب می شود تا موارد آسیب زننده مانند واکنش های الکتروشیمیایی بر روی سطح میکروالکترودها، انجام نشود. ما به دام افتادن با روش rDEP و جدایش سلول های زنده و مرده ی مخمر را با استفاده از روش های عددی و تجربی، بررسی کردیم.
آزمایش
ساخت میکروکانالمیکروکانال از جنس پلی دی متیل سیلوکسان (PDMS) و با استفاده از روش لیتوگرافی استاندارد(SU 8-25, MicroChem, Newton, MA)، تولید می شوند. به طور خاص، از روش فوتورسیت بر روی اسلایدهای شیشه ای تمیز، استفاده می شود و بر روی این بخش، یک سرعت زاویه ای در حد 2000 RPM ایجاد می شود.. فیلم فوتورسیست ایجاد شده، که دارای ضخامت 25 میکرون است، در دستگاه هات پلیت دیجیتال نرم می شود. این کار در دو مرحله، یکی در دمای 65 درجه ی سانتیگراد به مدت 3 دقیقه و دیگری در دمای 95 درجه به مدت 7 دقیقه، انجام می شود. این فیلم سپس تحت تابش نور UV قرار می گیرد. با این روش یک ماسک منفی با الگوهای میکرکانالی ایجاد می شود. بعد از مرحله ی سخت سازی دو مرحله ی در دماهای 65 درجه به مدت 1 دقیقه و دمای 95 درجه به مدت 3 دقیقه، فوتورسیست عمل آوری شده، در محلول توسعه ی SU-8 ایجاد می شود. این کار در زمانی برابر با 4 دقیقه، انجام می شود. نتیجه ی حاصله یک نسخه ی دقیقق از میکروکانال ها بر روی اسلاید شیشه ای است. بعد از شستشوی اندک در ایزوپروپیل الکل و پخت در دمای 150 دقیقه به مدت 5 دقیقه، فوتورسیست برای استفاده به عنوان قالب میکروکانال، آماده است.
بعد از آن، یک مخلوط با نسبت 10 به 1 از پیش ماده ی پلیمری و عامل عمل آوری PDMS (الاستومر سیلیکونی 184 Sylgrad)، آماده می شود و به داخل قالب میکروکانال وارد می شود. بعد از 30 دقیقه گازگیری در یک آون خلأ هم دما ، PDMS مایع در دمای 70 درجه در یک آون معمولی به مدت 2 ساعت، عمل آوری می شود. ریزساختار میکروکانال با استفاده از چاقوی کوچک جراحی بریده می شود و از قالب جداسازی می شود. دو حفره در دو انتهای کانال ایجاد می شود که در آزمایش، به عنوان منبع عمل می کنند. دیواره ی کانال PDMS سپس با استفاده از پلاسما، به مدت 1 دقیقه، عمل آوری می شود. در نهایت، دو سطح عمل آوری شده، به همدیگر می چسبند و میکروکانال را تشکیل می دهند.
شکل 1 نشاندهنده ی تصویری از یک وسیله ی میکروسیال PDMS- شیشه است که به همین شیوه، تولید شده است. این گفته شده است که طول میکروکانال حاصله، 3.3 میلی متر و قطر منبع برابر با 5 میلی متر می باشد. کانال حاصله 500 میکرون عرض دارد و بخش تنگ آن، 35 میکرون عرض دارد. این سطح با مقطع کوچکتر، به منظور کاهش در پتانسل الکتریکی مورد نیاز و افزایش میدان الکتریکی، ایجاد شده است. کانال به طور یکنواخت دارای عمق 25 میکرون است و شعاع ثابت آن برای تمام گوشه ها، 20 میکرون است.
آماده سازی سلول ها
سلول های مخمر (Saccharomyces Cerevisiae) در یک محیط سابارو دکستروز آگار کشت داده شد. این کار در یک انکوباتور با دمای 30 درجه انجام شد. بعد از 24 ساعت، 25 میلی لیتر از محیط کشت و سلول های مخمر، بوسیله ی سانتریفیوژ کردن در دور 10000 و زمان 10 دقیقه، جداسازی شد. ماده ی باقی مانده بر روی سطح، خارج شده و باقیمانده که حاوی سلول می باشد، دوباره در 2 میلی لیتر محلول نمک طعام، پراکنده سازی شد. سپس نمونه به دو قسمت تقسیم شد و هر قسمت در داخل یک تیوب 30-40 میلی لیتری وارد می شود. این تیوب ها یکی شامل 20 میلی لیتر محلول 0.85 % نمک طعام (برای مخمر زنده) و یکی شامل 20 میلی لیتر ایزوپروپیل الکل (برای مخمر مرده) می باشد. هر دو نمونه در دمای اتاق به مدت 1 ساعت انکوبه می شوند که نمونه در این انکوباتور، هر 15 دقیقه، به هم زده می شد. بعد از آن، این نمونه ها در سرعت 10000 به مدت 10 دقیقه، تحت عملیات سانتریفیوژ قرار گرفت و سپس محلول موجود در داخل تیوب های مجزا که محتوی 10 میلی لیتر نمک طعام 0.85 % بود، معلق سازی می شد. پیش از آزمایش، مخمرهای زنده و مرده حداقل سه مرتبه با آب شستشو شدند و در این شستشو از یک مینی سانتریفیوژ، استفاده شد (Fisher Scientific, Pittsburg, PA. دو نوع سلول، سپس در محلول بافر فسفات یک میلی مول معلق سازی شدند تا غلظت نهایی، به 〖10〗^6 سلول بر هر میلی لیتر، برسد. در آزمایش جداسازی، سلول های زنده ی مخمر با مواد فلئورسنت سبز از نوع SYTO 9 علامت گذاری شدند. این کار پیش از مخلوط کردن آنها انجام شد. قطر متوسط مربوط به سلول های زنده و مرده، به ترتیب، 6 و 5 میکرون، اندازه گیری شد.روش های تجربی
جداسازی دی الکتوفورز سلول ها در اتصال منبع- میکروکانال، با استفاده از ایجاد میدان های الکتریکی AC بایاس شده با DC در داخل کانال، انجام شد. میدان الکتریکی بوسیله ی یک مولد توان فرکانس بالا، تولید شد. فرکانس میدان AC از 1kHz تا 500 kHz متغیر بود. جریان ایجاد شده بوسیله ی فشار، به طور دقیق با استفاده از ارتفاع های مایع موجود در دو منبع، پپش از آزمایش، مورد ارزیابی و اندازه گیری، قرار گرفت. مخزن ها بزرگ و دارای قطری برابر با 5 میلی متر بودند و ارتفاع آنها 3 تا 4 میلی متر بود تا بدین صورت، جریان بازگشتی در حین اندازه گیری، مینیمم باشد. حرکت سلول با استفاده از میکروسکوپ تبدیل شده، اندازه گیری شد. همچنین با استفاده از این وسیله، از اتصال منبع- میکروکانال، تصویر و ویدئو بدست آمد. این کار با استفاده از زدوربین CCD انجام شد.تئوری
اصول مربوط به rDEPبه دلیل عدم تطابق قابل توجه میان قطر منبع (5 میلی متر) و قطر میکروکانال (35 میکرون)، میدان الکتریکی به طور ذاتی در نواحی ساختاری، غیر یکنواخت می گردد. این مسئله با میدان شمار، مورد تأیید قرار گرفته است. شکل 2 نششاندهنده ی توالی مربوط به سطح مشترک حرکت دی الکتروفورز القا شده (U_DEP) می باشد این توالی در زمانی ایجاد می شود که سلول ها به صورت الکتروکینتیکی، از داخل سطح مشترک ماکرو- میکرو، عبور می کنند. این حرکت سپس rDEP نامیده می شود. با استفاده از تخمین ممنتوم نقطه ی دوقطبی،متوسط زمانی مربوطه به U_DEP یک سلول سلب کروی، به صورت زیر بدست می آید:
ثابت دی الکتریک مختلط سلول های زنده و مرده ی مخمر می تواند با استفاده از مدلی محاسبه شود که به آن، مدل چند پوسته ای، می گویند. در این مدل، این در نظر گرفته می شود که سلول ها سه لایه ی هم مرکز با خواص دی الکتریک مختلف دارند. جزئیات مربوط به این مدل، و پارامترهای مربوطه، در پیوست آروده شده است. شکل 3 فاکتور CM پیش بینی شده بوسیله ی مدل را برای دو نوع از این سلول ها را مورد بررسی قرار می دهد. این سلول ها در داخل بافر فسفاتی یک میلی مولار رقیق سازی شده اند. در این شکل، فاکتور CM نسبت به تغییر در فرکانس میدان AC ترسیم شده است. به دلیل اختلاف های موجود در رسانایی الکتریکی غشاء سلولی و سیتوپلاسم، سلول های زنده و مرده ی مخمر نسبت به میدان AC پاسخی متفاوت دارند. در گستره ی یک میدان DC خالص (یعنی فرکانس صفر) و یک میدان AC با فرکانس500kHz، هر دو نوع سلول دارای فاکتور CM منفی هستند و از این رو، DEP منفی دریافت می کنند (به بخش های خط تیره دار در شکل 3 توجه کنید، که بوسیله ی آنها، نمودار به دو قسمت مثبت و منفی تقسیم شده است). برای میدان های AC با فرکانس کمتر از 100kHz، سلول های زنده ی مخمر، rDEP قوی تری نسبت به سلول های مرده، دریافت می کنند (یعنی فاکتور CM آنها دارای مقداری بزرگ است). در فرکانس حدود 200 kHz،پاسخ DEP در دو نوع سلول، قابل مقایسه می شود و تفاوت نسبی آنها حفظ شده است. برای فرکانس های بالاتر از 300kHz (و کمتر از 500 kHz)، سلول های مرده، rDEP منفی تری نسبت به سلول های زنده، دریافت می کنند.
که در اینجا، μ_EK موبیلیته ی الکتروکینتیکی سلول است که می تواند به صورت تجربی و با ردیابی سلول های منفرد در میدان های الکتریکی خالص DC محاسبه شوند. توجه کنید که حرکت های ناشی شده از اینرسی، حرکت برونی و جاذبه ی زمین، در معادله ی چهارم صرفنظر شده است. مشابه با آنچه ما قبلا انجام داده ایم، سرعت سلول (U_c) می تواند به صورت زیر بازنویسی شود:
<
که در اینجا، U_EK بزرگی سرعت الکتروکینتیکی جریان، U_(DEP,s) مقدار سرعت سلولی دی الکتروفورز، s ̂ بردار واحد مختصات S در طول جریان، U_(DEP,n)مقدار سرعت دی الکتروفورز جریان عرضی، n ̂ بردار واحد مربوط به مختصات عمود بر خط جریان و R شعاع محلی نمودار خط جریان می باشد.
در آزمایش های ما، فرکانس میدان الکتریکی AC کمتر از 500 kHz در نظر گرفته می شود تا بدین صورت، اطمینان حاصل شود که در اتصال منبع- میکروکانال، rDEP برای هر دو نوع سلول مرده و زنده، منفی باشد (شکل 3). بنابراین، U_(DEP,n) به سمت خط مرکزی کانال هدایت می شود (تجزیه و تحلیل مربوط به سرعت در شکل 1 را ببینید). این مورد موجب ایجاد اثر متمرکز کننده بر روی سسلول های معلق در داخل اتصال منبع- میکروکانال می شود. در این میان، U_(DEP,s) مخالف U_EK است و بنابراین، موجب کاهش سرعت تمام سلول ها در محل اتصال می شود (شکل 1). علاوه بر این، از آنجایی که U_(DEP,s)در میدان های AC و DC ، یک تابع درجه دو است و U_EK تنها به صورت خطی با میدان DC در ارتباط است، این فهمیده شده است که U_(DEP,s) می تواند موجب تعادل در U_EK شود. این مسئله زمانی رخ می دهد کهE_DC یا E_AC افزایش می یابد. در این نقطه و خارج از ان، سرعت سلول ها، کاهش می یابد و سلول ها می توانند در جلوی اتصال ذخیره- میکروکانال، ساکن شوند. یعنی
یا
که در اینجا،
نسبت RMS میدان AC به DC است. توجه کنید که برای DEP سلولی منفی، 
است. مقدار مورد نیاز برای α در سلول های به دام افتاده، تابعی از دو نسبت موبیلیته ی سلولی است: یکی نسبت موبیلیته ی سلولی الکتروکینتیکی DC ( )و دیگری موبیلیته ی الکتروفورز DC ( 
)است. این دو کمیت بدون بعد هستند. بنابراین، ما می توانیم به طور بالقوه یک نوع از سلول ها را به دام بیندازیم یا غلظت سلول های یک نوع را افزایش دهیم.مدل سازی های عددی
شبیه سازی مربوط به حرکت الکتروکینتیکی سلول از منبع به میکروکانال، در نرم افزار COMSOL 3.5a انجام شده است. این کار به صورت مدل سازی دو بعدی، انجام شده است این مدل از حرکت های چرخشی ایجاد شده در سیال، صرفنظر کرده است. به جای آن، یک فاکتور تصحیح (λ_c) برای اثرات اندازه ی سلول بر روی سرعت دی الکتروفورز سلول ها، در نظر گرفته شده است. به همین نحو، سرعت سلول در معادله ی چهارم به صورت زیر بازنویسی شده است:
توزیع میدان الکتریکی
، با حل معادله ی لاپلاس 
، بدست می آید. همچنین پتانسیل الکتریکی DC (ϕ_DC) به صورت عملی اعمال می شود. الکترود موجود در هر مخزن بوسیله ی یک مدار هم محور با قطر 0.5 میلی متر، شبیه سازی می شود و بوسیله ی آن، یک پتانسیل الکتریکی اعمال می شود. مخصوصاً ولتاژ DC اعمال شده، بوسیله ی الکترودی ایجاد می شود که در کل مخزن قرار دارد. الکترود موجود در مخزن به زمین متصل شد. فرض شده است که تمام دیواره های میکروکانال، از لحاظ الکتریکی عایق است.سرعت سلول در معادله ی هفتم به عنوان ورودی برای تابع ردیابی ذره در COMSOL 3.5a مورد استفاده قرار گرفت. موبیلیته ی الکتروکینتیکی (μ_EK) با ردیابی حرکت سلول های منفرد در بدنه ی میکروکانال، محاسبه گردید. این موبیلیته برای سلول های مخمر زنده و مرده، برابر با
می باشد. موبیلیته ی دی الکتروفورز با استفاده از معادله ی دوم و با در نظر گرفتن ویسکوزیته ی دینامیک 
و ثابت دی الکتریک 
بدست می آید (این اطلاعات برای آب خالص در دمای 20 درجه انجام می شود). یک کد متلب برای محاسبه ی فاکتورهای CM در فرکانس های مختلف میدان الکتریکی، نوشته شد. این کد بر اساس مدل چند پوسته ای نوشته شد. فاکتور تصحیح (λ_c)برای هر دو نوع سلول برابر با 0.5 در نظر گرفته شد که نحوه ی محاسبه در مطالعه ی قبلی ما گفته شده است.نتایج وبحث
افزایش غلظت و به دام افتادن سلول های مخمر زنده با rDEP
تصاویر پیوست ی مربوط به این پدیده، در شکل 4 نشان داده شده است. این شکل نشاندهنده ی رفتارهای نمونه وار حرکت سلولی الکتروکینتیکی در داخل اتصال مخزن- میکروکانال، تحت میدان الکتریکی AC بایاس شده با DC است. سلول های مخمر زنده برای این نمایش، مورد استفاده قرار گرفته اند. ولتاژ DC اعمال شده، در سطح 2V حفظ شد تا بتوان ولتاژ DC برابر با 6 v/cm را در سطح طول میکروکانال ایجاد کرد. ولتاژAC اعمال شده (مقدار RMS) در فرکانس 1kHz ثابت نگه داشته شد در حالی که مقدار ولتاژ از صفر ( یعنی نسبت ولتاژ AC به DC برابر با صفر) تا 30 ولت (یعنی نسبت ولتاژ AC به DC برابر با 15) و ولتاژ 50 ولت (یعنی نسبت ولتاژ AC به DC برابر با 25) متغیر است. تحت میدان DC مطلق، سلول از میان اتصال منبع- ذخیره، به صورت یکنواخت توزیع شده است (شکل 4a). این مسئله به دلیل rDEP ناچیزی است که در اتصال و تحت میدان DC ایجاد شده است.
مقایسه ی rDEP در به دام انداختن سلول های مخمر زنده و مرده
ما به دام افتادن rDEP سلول های مخمر زنده را تحت میدان های الکتریکی AC بایاس شده با DC در گستره ی فرکانس 1 تا 500 kHZ مورد ارزیابی قرار دادیم. ولتاژ DC در طی کل اندازه گیری، 2 ولت ثابت شد. نسبت ولتاژ AC به DC (α) برای یک به دام افتادن سلولی پایدار، که در اتصال منبع- میکروکانال اتفاق می افتد، در شکل 5a نشان داده شده است. این نسبت ولتاژی نسبت به فرکانس میدانی AC می باشد. به دلیل کاهش در مقدار فاکتور CM با افزایش فرکانس (شکل 3)، سلول ها باید یک rDEP ضعیف تری را در هنگام افزایش فرکانس، تجربه کند. این مسئله مخصوصاً وقتی رخ می دهد که فرکانس بیش از 100 kHz است. این مسئله توضیح می دهد که چرا نسبت ولتاژ AC به DC اندازه گیری شده، با افزایش فرکانس (شکل 5a) رویه ای دارد که مشابه با رویه ی پیش بینی شده می باشد. ما همچنین به دام افتادن سلول های مخمر مرده را با رویه ای مشابه بدست آوردیم. داده های تجربی و پیش بینی های عددی مربوطه، در شکل 5b نشان داده شده است. یک رویه ی مشابه برای سلول های مرده و زنده، مشاهده شده است.
بنابراین، سلول های مخمر مرده، به دام می افتند و غلظت آنها در داخل منبع، بیشتری می شود، در حالی که سلول های مخمر زنده، از میان میکروکانال می گذرند. البته این کار به دو شیوه انجام می شود. یکی آنکه با استفاده از فرکانس میدان AC و دیگری با استفادهل از ثابت نگه داشتن نسبت میدان AC به DC.
از لحاظ فنی، جداسازی rDEP مربوط به سلول های مخمر زنده و مرده در محل اتصال منبع- میکروکانال، می تواند با استفاده از تنظیم نسبت میدان های AC به DC در کل ناحیه ی 2 از شکل 6 انجام شود. به هر حال، از لحاظ فنی، ما نیازمند این هستیم تا یک زوج از فاکتورها را در نظر بگیریم. یکی از این فاکتور، فاصله ی میان میدان های AC به DC برای به دام افتادن سلول های زنده و مرده است که این فاصله، هر چه بیشتر باشد، بهتر است. این مسئله موجب می شود تا طراحی و کنترل وسیله، به نسبت، ساده شود. شکل 6 نشان دهنده ی این است که ما می توانیم از فرکانسی در گستره ی 1-100 kHz یا 300-400 kHz استفاده کنیم. فاکتور دوم، فرکانس میدان AC است که باید تا حد ممکنه پایین تر باشد. علت این مسئله، این است که میدان های AC بزرگتر را باید در فرکانس های بالاتر استفاده کرد که این مسئله موجب بروز دو مسئله می شود: 1) حرارت ژول و اثرات الکتروشیمیایی ممکن است موجب بروز اثرات نامطلوب بر روی نمونه و وسیله شود. و 2) انتخاب آمپلی فایرهای تجاری موجود به طور قابل توجهی به ولتاژ محدود می باشد.
با در نظر گرفتن این فاکتورها، ما جداسازی rDEP را به صورت عملی در میدان های AC بایاس شده با DC انجام دادیم که فرکانسی کمتر از 1 kHz دارند. این واضح است که استفاده از ولتاژ 47.5 V AC و بایاس 4 ولتی، می تواند یک غلظت گزینشی و جدایش پیوسته ای را در بین سلول های مخمر زنده و مرده، ایجاد کند. نتایج تجربی و عددی در شکل 7 نشان داده شده است. شکل 7a نشاندهنده ی یک تصویر لحظه ای از رفتار سلول ها در محل اتصال است که در آن سلول های مرده ی بدون برچسب فلئورسنت، در داخل منبع به دام می افتند در حالی که سلول های زنده ی حاوی برچسب فلئورسنت، وارد میکروکانال می شوند. تصویر خطی مربوط به سلول های زنده و مرده، در شکل 7b و 7c نشان داده شده است. بررسی آماری نشاندهنده ی تطابق مناسب میان نتایج عملی و تئوری است.
نتیجه گیری
ما یک روش جدید برای جداسازی پیوسته ی سلول های موجود در میکروکانال ها با استفاده از روش rDEP ارائه کرده ایم. انتقال، متمرکز شدن و به دام افتادن سلول های مرده و زنده ی مخمر در اتصال مخزن- میکروکانال، با تغییر ساده ای در میدان AC بایاس شده با میان DC، ایجاد شده است. این پدیده می تواند بوسیله ی مدل دو بعدی پیشنهاده شده بوسیله ی ما، توصیف گردد. ما همچنین مطالعه ی اساسی بر روی نسبت میدان AC به DC و در یک گسترده ی بزرگ، انجام دادیم که نتایج نشاندهنده ی تطابق خوب نتایج تجربی با نتایج شبیه سازی است. در فرکانس مورد بررسی، نسبت میدان AC به DC برای به دام افتادن سلول های مخمر زنده، بالاتر از نسبت مورد نیاز برای به دام افتادن سلول های مرده است. تفاوت در این نسبت، برای ایجاد غلظت های گزینشی و جدایش پیوسته ی سلول های مخمر مرده از سلول های زنده، در محل اتصال، منبع- میکروکانال، ضروری است. از آنجایی که جدایش سلولی در داخل منبع انجام می شود، مسئله ی رسوب گیری نیز ممکن است رخ دهد. که این روسبات باید جداسازی شود. علاوه بر این، کل میکروکانال می تواند مورد بررسی آنالیزهای ثانویه قرار گیرد و این دستگاه را می توان در آزمایشگاه، به همراه سایر دستگاه ها، استفاده کرد و از آن برای کاربردهای بیوپزشکی، بهره برد.
محاسبه ی ثابت دی الکتریک مربوط به سلول های زنده و مرده
پاسخ دی الکتروفورز مربوط به سلول های زنده و مرده، در میدان های الکتریکی، متفاوت است. یعنی فاکتور CM در معادله ی دوم با استفاده از یک مدل دو پوسته ای، قابل محاسبه است. همانگونه که به صورت آماری در شکل 8 قابل مشاهده است، یک سلول در این مدل، به عنوان یک پوسته ی دی الکتریک، در نظر گرفته می شود که بوسیله ی دو لایه ی هم محور پوشیده شده است. ثابت دی الکتریک مختلط یک چنین سلولی (ε_c^*) در معادله ی سوم، به صورت زیر محاسبه می شود:
در بالا، ε_1^*، ε_2^* و ε_3^* به ترتیب، ثابت دی الکتریک دیواره ی سلولی، غشاء و هیته است و به صورت زیر تعریف می شود: ε^*=ε-iσ/w. مقادیر مربوط به شعاع، رسانایی الکتریکی (σ) و ثابت دی الکتریک برای هر سه لایه در شکل 8 نشان داده شده است.
استفاده از مطالب این مقاله، با ذکر منبع راسخون، بلامانع می باشد.
