كارگاه عملي – نظري كلونينگ , نشاندار كردن و هيبريديزاسيون اسيد هاي نوكلئيك(قسمت اول)
نویسنده: دكتر بهرام كاظمي
ابزار هاي كار مهندسي ژنتيك در آزمايشگاه عبارتند از :
1- باكتري بعنوان ميزبان
2- پلاسميد به عنوان حامل ژن
3- آنزيم بعنوان وسيله برش و اتصال قطعات DNA به يكديگر
F or F`( Fertility)) : اپي زومي كه پيلي جنسي ايجاد ميكند . قسمت هايي از كروموزوم E.coli مانند اپرون ( Lac - pro A) روي F` قرار دارد. براي آلوده كردن باكتري به فاژ M13 يا فاژ هاي كمكي ( M13K07 , R408 ) فاكتور F` لازم ميباشد. اين فاكتور براي توليد DNA تك رشته اي از فاژ( فارميد ) مفيد ميباشد .
ْْْْْْْْْْْْْْْْْhsd R - اين موتاسيون موجب كاهش خاصيت رستريكشن EcoK ميشود اما روي متيلاسيون تاثيري ندارد. باكتري كه داراي اين موتاسيون باشد DNA خارجي بدون اينكه توسط R.ENase نوع I هضم شود وارد آن ميشود.
hsd S باكتري كه داراي اين موتاسيون باشد فعاليت متيلاسيون و رستريكشن آن كاهش ميابند.
mcr- ( Methyl Cytosine Restriction) ) اين موتاسيون اختصاصا" روي هر دويا يكي ازسيستم هاي McrA و McrB تاثير ميكند. ژن McrA روي كروموزوم E.coli قرارداشته وكد كننده فعاليت Restriction - Methylation اختصاصي براي CmCGG ميباشد . ناحيه mcrB در روي كروموزوم حاوي دو ژن mcrB و mcrC است . محصول اين دو ژن موجب تشكيل نوكلئاز وابسته به هترو دايمر GTP ميشود. سومين فعاليت mcr بنام mcrF گفته ميشود( به mrr مراجعه شود ). اگر در Dcm تغييري ايجاد شده باشد با +Mcr هضم نميشود.
mrr- قسمتي از سيستم رستريكشن وابسته به متيلاسيون(MDRS) است . اين ژن DNA حاوي آدنين هاي متيله شده را هضم ميكند. ژن mrr روي ترادف هاي حاوي سيتوزين متيله( CpG) فعاليت Restriction دارد. اين فعاليت اشاره به mcrF ميباشد. اگر درDam , Dcm يا EcoK تغييري ايجاد شود DNA با Mrr مثبت ويا هرسيستم رستريكشن ديگر E.coli K12 هضم نميشود.
proA - اين موتاسيون فعاليت گاما گلوتاميل فسفات ردكتاز را كاهش ميدهدو بيوسنتز پرولين ناقص ميگردد. باكتري موتانت براي رشد خود به اسيد آمينه پرولين نياز دارد.
proB - اين موتاسيون موجب كاهش فعاليت آنزيم گاما گلوتامات كيناز شده وبه نقص بيوسنتز پرولين منجر ميشود . باكتري موتانت براي رشد خودبه اسيد آمينه پرولين نياز دارد.
ara A - درژن سيستم ال- آرابينوز ايزومراز باكتري موتاسيون رخ داده است و باكتري موتانت نميتواند از آرابينوز استفاده كند.
araC - در ژن رگولاتوري ( پروتئين اكتيواتور/ رپرسور ) موتاسيون رخ داده است
galK - (galA) ژن ساختماني گالاكتوكيناز است. باكتريهاي موتانت نمي توانند گالاكتوز را مصرف كنند. اين موتانتها از گالاكتوز Expression Vector استفاده ميكنند.
LacY- اين موتاسيون موجب كاهش فعاليت گالاكتوز پرمئاز ( پروتئين M ) ميشود و باكتري نميتواند از لاكتوز استفاده كند .
recAI- اين موتاسيون موجب كاهش نو تركيبي هومولوگ و افزايش پايداري DNA كلون شده ميگردد. رشد اين سويه ها كند است و كارآيي ترانسفر ماسيون آنها پايين است.
rpsL- درژن زير واحد S12 ريبوزوم 30S موتاسيون ايجاد ميشود كه موجب مقاومت به استرپتومايسين ميشود. اين ژن بصورت StrA هم نوشته ميشود.
e14- اپي زوم شماره 14 حاوي ژن mcrA1 ميباشد و حذف آن موجب صفت McrA منفي در باكتري ميشود. حذف e14 منجر به آللهاي ديگر McrA ميشود.
supE44- اين موتاسيون موجب ميشود كه به جاي UAG كه كدون متوقف كننده است اسيد آمينه Gln در زنجيره پپتيدي قرار بگيرد. اين سويه ها حاوي ژن (gln V ) براي گلوتامين tRNA2 ميباشند كه براي رشد فاژها لازم ميباشند.
xyLA - موتاسيوني كه درD- گزيلوز ايزومراز ايجاد ميشودوباكتري موتانت نمي تواند گريلوز را مصرف كند.
LacIq- ايجاد موتاسيون در پروموتور i ( ژن رپرسور ) كه منجر به توليد 10 برابر رپرسور لاكتوز ميشود. اين موتان براي توقف بيان ( اكسپرس ) ژن از طريق پروموتور لاكتوز مفيد ميباشد.
amber codon - كدون UAG كه متوقف كننده ( Termination ) سنتز پروتئين است بنام آمبر كدون گفته ميشود.
Tn10- ترانسپوزوني كه موجب مقاومت به تتراسيكلين ميشود ( Tetr) .
endA -اين موتاسيون بصورت غير اختصاصي DNA endonuclease I را غير فعال ميكند . اين موتاسيون براي جدا كردن پلاسميد DNA مفيد ميباشد و كيفيت آن را بهبود مي بخشد.
gyrA96 -موتاسيون درژن زير واحدA آنزيم DNA gyrase ايجاد ميشود و باكتري به ناليديكسيك اسيد مقاوم ميگردد.
thi I(thi A)- موتاسيون درژن سنتز تيازول ايجادشده است وبراي رشد باكتري تيامين ( ويتامين B123 ) با منشاء خارجي نياز ميباشد.
supE - باكتري موتانت كدون UAG ( كدون ختم زنجيره ) را بعنوان كدون گلوتامين شناسايي ميكند. هنگام سنتز پروتئين وقتي با UAG مواجه شود اسيد آمينه گلوتامين وارد زنجيره پلي پپتيدي ميشود. كدون UAG بصورت عادي يك كدون متوقف كننده است .وكتور M13 براي كدون UAG درچندين ژن موجوددر ژنوم فاژ طراحي شده بود اين وكتورها فقط درسويه هاي آزمايشگاهي ذرات فاژ توليدميكردند. ژن آنها بطورصحيح در باكتري هاي سويه وحشي ترجمه نميشد (مانند باكتريهايي كه در روده زندگي ميكنند) وقادربه رشددرمحيط خارج از آزمايشگاه نبودند. اين ايده موجب جلوگيري از آزادكردن باكتريهاي مهندسي شده درمحيط گرديد.
F`[traD36]- ژن TraD درانتقالDNA ازطريق كنژوگاسيون دخالت دا (Fertility plasmid ) . ژن موتاسيون يافته ازكنژوگاسيون باكتري جلوگيري ميكند. پلاسميد هاي F` هنگام كنژوگاسيون از يك سلول به سلول ديگر منتقل ميشوند و يك پلاسميد مهندسي شده ميتواند به يك باكتري وحشي منتقل شود ( يعني باكتري ترانسفرم شده از پتري ديش خارج شود ). موتاسيون traD36 با كاهش پديده كنژوگاسيون يك نوع ايمني ميباشد كه از ايجاد حادثه جلوگيري ميكند.
F`[ proAB+] - اين موتاسيون موجب حذف ژنهاي بيوسنتز پرولين از باكتري شده واين ژنها در پلاسميد F` مستقر شده اند. بنا براين باكتري ميتواند پرولين را سنتز كند و احتياجي به اضافه نمودن پرولين به محيط كشت نميباشد ( تا زماني كه باكتري پلاسميد F` داشته باشد ). اگر باكتري پلاسميد F` خود را از دست بدهد ( مثلا" وقتي باكتري مدت زيادي در كشت آگار نگهداري شود ) به proAB منفي تبديل ميشود و باكتزي فقط در حضور پرولين رشد ميكند. اگرباكتري پلاسميد F` خود را از دست بدهد مدت زيادي نميتواند پيلي جنسي بسازد وبا فاژ M13 آلوده نميشود. بنا برا ين كشت باكتري در محيط minimum كه فاقد پرولين است انجام ميگيرد و به اين معني است كه فقط سلولهايي كه پلاسميد F` دارند و به M13 آلوده ميشوند ميتوانند زنده بمانند.
F`[LacZΔM15] - lacZ ژن بتا گالاكتوزيداز است . ΔM15 يعني اين نسخه از ژن LacZ فاقد كدونهاي 41-11 است . كدونهاي 41-11 مخصوص قسمتي از پروتئين LacZ هستند كه بنام پپتيد آلفا گفته ميشود. در غياب اين پپتيد آنزيم بتا گالاكتوزيداز ناقص است ( براي فعاليت آنزيم ، سلول بايد داراي ژن LacZ` باشد كه براي Missing peptide كد شود) . ژن LacZ` روي وكتور است وسلولهاي حاوي اين وكتورها ميتوانند ژن بتا گالاكتوزيداز كامل توليد كنند، بنا بر اين وكتور و سلول با همديگر در پديده Lac selection همكاري دارند.
نقش ژن LacZ- اين ژن ماركر انتخابي با كتري نوتركيب ميباشد و 140 اسيد آمينه آنزيم بتا گالاكتوزيدازباكتري E.coli را كد ميكند . ژن مذكورلاكتوزرا به گلوكز و گالاكتوز تبديل ميكند. پروتئيني كه توسط LacZكد ميشود به تنهايي براي تبديل لاكتوز به گلوكز و گالاكتوز كافي نيست و با يك قطعه ثانوي كه حاوي بقيه پروتئين بتا گالاكتوزيداز است كامل ميشود و آنزيم فعال توليد ميكند. اين پپتيد ثانويه توسط وكتور (براي ترانسفر ماسيون در آزمايش كلونينگ استفاده ميشود ) سنتز ميشود . واكنش ترانسفرماسيون باكتري با وكتورحاملLacZ` روي پليت آگار حاوي ) X-gal 5- برومو، 4 -كلرو، 3 - ايندوليل - بتا گالاكتوپيرانوزيد ) كه آنالوگ لاكتوز است پخش ميشود.
سيستم Lac selection بصورت زير كار ميكند: (Lac Operon)
سلولي كه حاوي وكتور كلونينگ با يك ژن LacZ` بكر ( دست نخورده ) است ميتواند بتا گالاكتوزيداز را سنتز كند اين آنزيم همراه با IPTG كه يك القا كننده است X-gal را به تركيب آبي رنگ برومو كلرو ايندوليل تبديل ميكند . اين سلولها كلني آبي رنگ (فقط حاوي پلاسميد هستند ) يا پلاك آبي رنگ ( حاوي فاژ ) توليد ميكنند. سلولهاي نوتركيبي كه ژن LacZ` آنها توسط Inserted DNA تخريب شده است نميتوانند بتا گالاكتو زيداز را سنتز كنند و كلني هاي سفيد يا پلاك هاي شفاف توليد ميكنند
- بافر هاي مورد نياز در آزمايشگاه بيولوژي مولكولي
اولين وظيفه فرد در آزمايشگاه مولكولار بيولوژي تهيه بافر هاي مورد نياز ميباشد. همه واكنشهاي بيولوژي در بافر مخصوص انجام ميشوند . معمولا"مواد اصلي بافر هارا در آزمايشگاه بصورت ذخيره ((Stock تهيه ميكنند و بافر هاي مورد نياز روزانه را از مواد ذخيره تهيه مينمايند . بعضي از مواد ذخيره و مولاريته آنهابه اين شرح است:
براي تهيه محلول كار از مواد ذخيره از فرمول زير استفاده ميشود
M1V1=M2V2
M1 مولاريته ماده ذخيره V1حجم ماده ذخيره كه بايد براي بافر برداشته شود
M2مولاريته بافر موردنياز V2حجم بافرخواسته شده
مثلا" براي تهيه 50 ميلي ليتر TE بافر ( 10 ميلي مولار تريس و 1ميلي مولار EDTA ) چنين عمل ميكنيم :
50x10 = ?x1000, 500:1000= 0.5cc ( 500 μl) Tris
50x1 = ? x500 , 50:500 = 0.1cc ( 100μl ) EDTA
روش كار: 500μl از بافر تريس و 100μl از EDTA را درظرف مدرج ( لوله فالكن ) ريخته و حجم آن را به 50ml ميرسانيم .
3- تهيه محيط LB brothبراي كشت باكتري ( E.coli )
هدف از آموزش اين قسمت تهيه محيط مايع براي كشت با كتريهاي مورد استفاده در كار هاي بيولوژي مولكولي ميباشد
1- مواد زير را وزن كرده درون ارلن ماير ريخته و روي Stirrer مخلوط كنيد
تريپتون 5/2 گرم سديم كلرايد5/2 گرم
عصاره مخمر25/1 گرم آب مقطر250 ميلي ليتر
2- pH محيط را مساوي 5/7-7 تنظيم كنيد و سپس آن را اتوكلاو نماييد. مقدار لازم از آن را درون لوله مناسب ريخته ( در صورت نياز آنتي بيوتيك مناسب به آن اضافه نماييد ) و بصورت استريل ( كنار شعله ) يك كلني از سلول مورد نظر را درآن كشت داده ويك شب در 37 درجه آن را Shake كنيد.
4- تهيه آگار پليت
هدف از انجام اين كار تهيه محيط كشت جامد براي كشت باكتريها ميباشد. به محيط LB مقدار 5/1 درصد وزني پودر آگارآگار اضافه كرده وروي شعله قرار دهيد تا خوب بجوشد تا آگار كاملا" حل شده ومحلول شفاف بدست آيد سپس آن را اتوكلاو كنيد.مقدار 100μg / ml آمپي سيلين ( يا هر آنتي بيوتيك مناسب ديگر ) به آن اضافه كنيد.محيط را داخل چند پليت تقسيم كرده و در حرارت اتاق قرار داده تا آگار سفت شود سپس آنها را لاي كاغذ پيچيده و تا هنگام استفاده دربرودت 4 درجه نگهداري نماييد.
اطلاعات بيشتر
5- تهيه آنتي بيوتيك هاي مورد نياز كارگاه :
الف ) 500mg آمپي سيلين ( يك ويال) رادر 5 سي سي آب مقطراستريل حل كنيد غلظت آن100mg/ml است و هر ميكرو ليتر اين محلول حاوي 100μg آمپي سيلين است .آمپي سيلين با غلظت نهايي 100μg/ml مصرف ميشود. براي هر ميلي ليتر محيط كشت ( LB broth يا آگار پليت ) يك ميكروليتر از اين محلول استفاده ميشود.ب) تتراسيكلين ( ويال يا كپسول ) را با غلظت 25mg/ml در متانول حل كنيد و در لوله هاي يك ميلي ليتري تقسيم كرده فريزر كنيد. اين آنتي بيو تيك با غلظت نهايي 12.5μg/ml مصرف ميشود . براي هر ميلي ليتر محيط كشت( LB broth يا آگار پليت ) 0.5 ميكروليتر از اين محلول استفاده ميشود ( ميتوان محلول ذخيره تتراسيكلين را با غلظت 12.5mg/ml تهيه نمود سپس براي هر ميلي ليتر محيط يك ميكروليتر از ملول ذخيره اضافه نمود).
6- تهيه سلول پذيرا ( Competent cell )
هدف ازآموزش اين قسمت كسب مهارت براي تهيه سلول باكتري است بطوري كه طي پروسه اي كه روي آن انجام ميگيرد باكتري زنده بماند و پلاسميد (Circular DNA ) بتواند وارد آن شود. سرما وكلسيم كلرايد و متعاقب آن شوك گرمايي ( Heat shock) كه به سلول وارد ميشود تغييراتي در سطح سلول ايجاد ميشود وDNA پلاسميدي از طريق مناقذي كه روي سطح سلول ابجاد شده اند وارد آن ميگردد.
روش كار:
1- يك كلني از باكتري مورد نظر را در 3 ميلي ليتر محيط LB كشت داده ويك شب در 37 درجه روي شيكرانكوبه كنيد
2. يك حجم از كشت شبانه باكتري مورد نظر رادر ده حجم محيط LB كشت دهيد ( بنا به دلايلي كه بعدا" توضيح داده ميشود در اين كارگاهها از دو سويه HB101 و XL1-blue باكتري E.coli كه خصوصيات آنها نيز توضيح داده خواهد شد استفاده ميگردد)
3. مدت2.5ساعت در حرارت و rpm مناسب آن را Shake كنيد تا به OD600 = 0.6 برسد
4. مقدار يك ميلي ليتر آن را به لوله ميكروفيوژ انتقال دهيد
5. لوله حاوي سلول را ده دقيقه روي يخ قرار دهيد
6. مدت 5 دقيقه با 3500rpm سانتريفيوژ كنيد ( بهتر است در 4درجه انجام شود )
7. مايع رويي را خالي كرده ولوله را وارونه روي كاغذ جاذب الرطوبه قرار دهيد تا آب آن خارج شود
8. رسوب را بايك سوم حجم اوليه از محلول 100mM CaCl2 سوسپانسيون كنيد ( محلول نبايد ورتكس شود بلكه با ضربه انگشت آن را حل كنيد) و ده دقيقه روي يخ قرار دهيد
9. مانند مرحله 5 آن را سانتريفيوژ كرده محلو ل رويي را خالي كنيد
10. رسوب را با يك دوازده ونيم حجم اوليه محلول CaCl2 سوسپانسيون كنيد ( با ضربه دست )
آن را درون ميكروفيوژ هاي مناسب تقسيم كرده وبراي Transformation استفاده كنيد.
7- Transformation ( انتقال Plasmid DNA به باكتري زنده )
هدف از آموزش اين قسمت كسب مهارت لازم براي انتقال پلاسميد به سلول باكتري ميباشد . اين كار در بيولوژي مولكولي از اهميت بالايي بر خوردار است . براي كار كردن با ژنها بايد حتما" آن ژن در يك پلاسميد كلون شود و سپس پلاسميد نوتركيب (Recombinant plasmid) به سلول باكتري منقل شود تاپس از همانند سازي پلاسميد، ژن ( DNA ) كلون شده در پلاسميد نيز به تبع آن همانند سازي كند .
1. سلول پذيرا ( Competent cell ) را روي يخ قرار دهيد
2. Plasmid DNA مورد نظر را (5ng) به آن اضافه كرده خوب مخلوط كنيد ( بنا به دلايلي كه بعدا" توضيح داده ميشود دراين كارگاهها از دوپلاسميد pBR322 وBluescript كه خصوصيات آنها نيز توضيح داده خواهد شد استفاده ميگردد)
3. - لوله حاوي سلول پذيرا ( Competent cell ) را مدت 30 دقيقه روي يخ قرار دهيد
4.- واكنش را مدت 40 ثانيه در آب گرم 42 درجه قرار دهيد ( شوك گرما )
5.- مدت 2-1 دقيقه روي يخ قرار دهيد
6-. مقدار 200 ميكروليتر محيط LB ( بدون آنتي بيوتيك) به آن ضافه كرده و 60-40 دقيقه در 37 درجه انكوبه كنيد (باكتر ي E.coli هر 20 دقيقه يك نسل تكثير ميكند ودر اينجا به آن فرصت داده ميشود تا دو يا سه نسل تكثيرنمايد ) . .
7- بصورت زير روي آگار پليت پخش كنيد ( توجه : همه محتواي لوله را روي پليت خالي كرده و با Spreader آن را روي سطح آگار داخل پليت پخش كنيد):
پليتA : Competent cell+ plasmid DNA و آنتي بيوتيك مناسب
پليت: B Competent cell ( آگار حاوي آنتي بيوتيك است )
پليتC : Competent cell ( آگار فاقد آنتي بيوتيك است )
8.- پليت را به انكوباتور منقل كرده ودرب آنها را نيمه باز بگذاريد تاسطح پليتها خشك شود
9- . پليت هارا بصورت وارونه يك شب در حرارت 37 درجه انكوبه كنيد
10- اگر پروسه كار خوب انجام شده باشد بعد از 12 ساعت روي سطح پليت كلني ها ظاهر ميشوند
11- تفسير نتايج : اگر كار درست انجام شده باشد بايد روي پليت هاي A و C كلني باكتري رشد كرده باشد ولي روي پليت B كلني باكتري مشاهده نگردد رشد كلني باكتريايي روي پليت B به اين معني است كه باكتري مورد استفاده قبلا"با يك پلاسميد حاوي ژن مقاومت به آنتي بيوتيك ترانسفرم شده است در اينصورت كلني هايي كه روي پليت A ظاهر شده اند فاقد اعتبار ميباشند . اگر روي پليت C كلني با كتر ي رشد نكند به اين معني است كه Competent cell خراب بوده و باكتريها در طول پروسه كار مرده اندو نبايد انتظار داشته با شيم كه روي پليت A هم كلني باكتري رشد كند .كلني هاي باكتريايي كه روي پليت A رشد ميكنند كلني هاي حاوي پلاسميد مورد نظر هستند.
8- پلاسميد ها :
پلاسميد يك مولكول dsDNA حلقوي است كه وارد باكتري ميشود و همانند سازي آن داخل سيتوپلاسم باكتري وبطورمستقل از ژنوم باكتري انجام ميگيردوبه آساني هم از باكتري استخراج ميشود. هرپلاسميد داراي يك(ori) Origin of Replication ( منشاء همانند سازي ) است كه همانند سازي پلاسميد از آن نقطه شروع ميشود . قسمتي از ترادف پلاسميد كه براي تعدادي از Restriction enzyme ها فقط يك جايگاه برش دارد و اين آنزيم ها در قسمتهاي ديگرترادف پلاسميد جايگاه برش ندارند Multiple Cloning Site گفته ميشود وبراي تهيه Recombinant DNA از آن استفاده ميشود يعني مولكول DNA خارجي در اين قسمت كلون ( Clone ) ميگردد.تعدادي از پلاسميد ها در طبيعت يافت ميشوند (در باكتريها و مخمرها ) ولي در مقايسه با كروموزوم سلول ميزبان بسيار كوچكتر مي باشند و اغلب در خارج كروموزوم باكتري ديده ميشوند.( تعدادي از پلاسميد ها براي كارهاي خاصي در آزمايشگاه طراحي و ساخته شده اند ). اگر چه پلاسميدها براي زندگي سلول باكتري ضروري نيستند ولي حاوي ژن مقاومت به يك آنتي بيوتيك ميباشند كه براي كارهاي مهندسي ژنتيك لازم و ضروري است. بعضي از پلاسميدها تعداد زيادي كپي در داخل سلول باكتري دارند كه بنام High copy number plasmid گفته ميشوند(همانند سازي اين پلاسميد ها به كروموزوم باكتري بستگي ندارد) و Relaxed Plasmid هم گفته ميشوند . تعداد ديگري ازپلاسميدها تعداد كپي محدود تري در داخل سلول باكتري ايجاد ميكنند كه بنام Low copy number plasmid معروف هستند و باكتري شديدا" Replication آنها را كنترل ميكند و به Stringent Plasmid هم معروف ميباشند. با تغييراتي كه در Sequence پلاسميد ها ايجاد ميكنند صفات خاصي در آنها بوجود مي آيد كه در مهندسي ژننتيك استفاده ميشوند .چنانچه ori دو پلاسميد از يك منشا باشند هنگام ترانسفورماسيون با هم رقابت كرده و فقط يكي از آنها وارد باكتري ميشود اما اگر منشا ori انها با هم اختلاف داشته باشد هنگام ترانسفور ماسيون دو پلاسميد نيز ميتوانند وارد يك سلول بشوند ( اين مسئله در كارهاي كلونينگ اهميت خاصي دارد ).كارهاي عملي در اين كار گاههاي آموزشي با دو پلاسميد انجام ميگيرد:
الف) پلاسميد pBR322 اين پلاسميد توسط فرانسيسكو بوليوار و همكاران طراحي و ساخته شده است و همه خصوصيات يك پلاسميد خوب را دارا ميباشد . وزن مولكولي پايين (4363bp ) دارد و براي تعدادي از Restiction Enzyme ها فقط يك جايگاه برش دارد . اين پلاسميد داراي دوژن مقاومت به آمپي سيلين و تترا سيكلين ميباشد و هنگاميكه وارد باكتري ميشود باكتري نسبت به دو آنتي بيوتيك مذكور مقاوم ميشود.قسمتي از ترادف اين پلاسميد (705bp ) را كه براي ادامه زندگي آن ضروري نميباشد با آنزيم HaeII برش داده و حذف كرده اند واز آن پلاسميدي بنام pT153 ساخته اند كه همانند سازي آن 5-3 برابر پلاسميد PBR322 ميباشد ب) پلاسميد Bluescript sk همانطور كه در شكل ديده ميشود ترادف ژن Lacz` ( قسمتN terminal ژن β-galactosidase ) بطوري روي پلاسميد تعبيه شده است كه Multiple Cloning Site اين پلاسميد قسمتي از ترادف ژن مذكور ميباشد. (جايگاه برش آنزيمها درقسمت هاي مختلف ترادف پلاسميد PBR322 قرار دارند ) كه درمهندسي ژنتيك براي انتخاب كلني هاي سفيد باكتريايي حاوي Recombinant DNA استفاده ميشود. در دو طرف MCS اين پلاسميد پروموتور فاژهاي T3 و T7 قرار داشته كه ژن كلون شده را بر حسب Orientation آن ميتوان توسط هر يك از پروموتورهاي مذكور بيان ( Express) نمود . اين پلاسميد داراي دو Original of Replication است كه يكي از باكتري E.coli و ديگري از فاژ F1 گرفته شده است كه به اين علت فاژميد هم گفته ميشود.. اين پلاسميد براي توليد ssDNA هنگام Sequencing يك قطعه DNA هم قابل استفاده ميباشد. در Bluescript sk (M13) جايگاه آنزيم SacI بلافاصله در Downstream پروموتور فاژ T7 و جايگاه آنزيم KpnI بلافاصله در Downstream پروموتورفاژ T3 قراردارند. پلي كلونينگ سايت Bluescript ks (M13)) در orientation مخالف پلاسميد Bluescript sk (M13-) قرار گرفته است.
9- استخراج پلاسميد در مقياس كم ( Minipreparation )
هدف از آموزش اين قسمت كسب مهارت براي استحراج پلاسميد از داخل باكتري ميباشد و همانطوريكه قبلا" گفته شد اين كار در مهندسي ژنتيك و بيولوژي مولكولي از اهميت بالايي برخوردار است. استخراج Plasmid DNA با روش آلكالين وبه صورت Miniprep در موارد Colony screening استفاده ميشود و براي كارهاي حساس تر پلاسميد بصورت Large scale استخراج ميگردد. ( دراين كارگاه فقط Miniprep انحام ميشود). براي استخراج پلاسميد سلول باكتري با محلول GTE ( گلوكز، تريس ، EDTA ) ليز شده و محتويات آن آزاد ميشوند . Genomic DNA و پروتئينهاي سلولي را با محلول قليا ( NaOHو SDS ) دناتوره كرده(در اين روش DNA سوپر كويل دناتوره نميشود) و بلافاصله با اسيدي كردن محيط و ايحاد سرما Genomic DNA و پروتئينهارا رسوب ميدهيم. در اين پروسه Plasmid DNA بصورت محلول باقي ميماندكه توسط سانتريفيوژآنرا از فازآلي ( پروتئين ها ) جدا ميكنيم .
روش كار:
1- مقدار 5/1 ميلي ليتر كشت شبانه ( باكتري حاوي پلاسميد) را بمدت5 دقيقه با 4500rpm سانتريفيوژ كنيد . عده اي معتقدند چنانچه رسوب را با محلول STE سوسپانسيون كرده و دوباره سانتريفيوژ كنيم ( شستشو دهيم ) واكنش هاي آنزيمي بهتر انجام ميشود
[ STE = 100mM NaCl , 10 mMTris ( pH=8) , 1mM EDTA (pH=8)]
2- رسوب را در 100μl محلول I سوسپانسيون ( محلول روي يخ سرد شده باشد )
محلول I : 50mM glucose , 25mm Tris , 10 mM EDTA (pH 8)
3-. ميكرو فيوژ حاوي واكنش را مدت 10-5 دقيقه در هواي اتاق قرار دهيد
4.- مقدار 200μl از محلول II تازه تهيه شده به لوله واكنش اضافه كرده ، درب لوله را ببنديد و با وارونه كردن آن محلول را خوب مخلوط كنيدو 5 دقيقه روي يخ قرار دهيد.
محلول II : 0.2N NaOH, 1% SDS
5- مقدار 150μl از محلول III (سردشده روي يخ ) به لوله واكنش اضافه كنيد . درب لوله را بسته و به آهستگي 10 دفعه آن را وارونه كنيد ومدت 15 دقيقه روي يخ قرار دهيد.
محلول III : 60 ميلي ليتر 5M AcoK , اسيد استيك 5/11 ميلي لير, آب مقطر5/28 ميلي ليتر ( اين محلول داراي 3مولار پتاسيم و 5 مولار استات است ) وقتي اين محلولبه واكنش اضافه ميشود بايد يك رسوب سفيد رنگ در داخل لوله پديدار گردد .
6- مدت 20 دقيقه با 12000xg آن را سانتريفيوژ كنيد
7- محلول رويي (تقريبا" 450 ميكرو ليتر ) را به لوله ديگر انتقال دهيد( حاوي پلاسميد ميباشد)
8- سديم استات با غلظت نهايي 0.3M به آن اضافه كنيد ( عده اي اين مرحله راضروري نميدانند )
9- دو برابر حجم آن اتانل مطلق سرد اضافه كنيد
10- مدت 15 دقيقه آن را سانتريفيوژ كنيد تا plasmid DNA رسوب كند . الكل را حذف كنيد ( حتما" لوله را وارونه روي كاغذجاذب الرطوبه قرار دهيد ).
11- روي رسوب الكل 70درجه ( 100 ميكرليتر) اضافه كنيد و آن را ورتكس كنيد بطوريكه pellet كنده شده و در الكل شناور شود
12- مدت 3دقيقه در حرارت اتاق آن را سانتريفيوژ كنيد ( شستشو دادن با الكل )
13- الكل را خالي كرده ورسوب را در حرارت 70 درجه خشك كنيد .
14- رسوب را در 50 ميكروليتر آب يا بافر TE )) حل كنيد
TE= 10mM Tris pH 8 , 1mM EDTA pH 8
10- استخراج پلاسميد در مقياس بالا (Large scale Plasmid DNA preparation) :
1. مقدار 500 ميلي ليتركشت شبانه را با 4000g به مدت 10 دقيقه سانتريفيوژ كنيد. مايع رويي را خالي كرده و لوله را وارونه روي كاغذ خشك كن قرار دهيد تا درناژشود. رسوب را با STE سوسپانسيون نموده و دو بار ه سانتزيفيوژ كنيدو سپس لوله وارونه قرار داده تا درناژ شود.
[ STE = 100mM NaCl , 10 mMTris- base ( pH=8) , 1mM EDTA (pH=8)]
2. رسوب را در10 ميلي ليتر محلول I حل كنيد.
Solution I: 50 mM glucose , 25 mM Tris ( pH 8), 10 mMEDTA
3. آن را خوب سوسپانسيون كنيد و 10 دقيقه در هواي اتاق قرار دهيد
4. مقدار 20 ميلي ليتر از محلول II تازه تهيه شده به آن اضافه كرده درب لوله را ببنديد و با وارونه كرده آن محلول را خوب مخلوط كنيدو 5 دقيقه روي يخ قرار دهيدمحلول
Solution II: 0.2N NaOH, 1% SDS
5. مقدار 15 ميلي ليتر از محلول III به به واكنش اضافه كنيد و15 دقيقه لوله را روي يخ قرار دهيد
Solution III : 60 ml of 5M ACOK , 11.5 ml of Acetic Acid , 28.5 ml of ddH2O
( اين محلول داراي 3مولار پتاسيم و 5 مولار استات است ) وقتي اين محلول اضافه ميشود بايد يك رسوب سفيد رنگ پديدار گردد ( ميتوان باپروخالي كردن محلول توسط پيپت پروتئينها را شكست )
6. مدت 20 دقيقه با 20000xg آن را سانتريفيوژ كنيد
7. محلول رويي ر ا (تقريبا" مقدار 15 ميلي ليتر) به لوله جديد انتقال دهيد
8. مقدار0.6 حجم اوليه ( 12 ميلي ليتر ) ايزو پروپانل به آن اضافه كنيد وخوب مخلوط كرده و 15 دقيقه در حرارت اتاق قرار دهيد
9. درحرارت اتاق و مدت 15 دقيقه آن را سانتريفيوژ كنيد تا plasmid DNA در ته لوله رسوب كند ( توجه : اگر در 4 درجه انجام شود نمك ها رسوب ميكنند )
مايع رويي را حذف كنيد ( حتما" لوله را وارونه قرار دهيد ) و رسوب رابا الكل 70درجه و در حرارت اتاق شستشو دهيد ( مقدار 10 ميلي ليتر الكل 70 درجه به هر لوله اضافه كرده و با 17000g بمد ت 10 دقيقه سانتريفيوژ كنيد ). الكل را خالي كرده و آن را در حرارت 70 درجه خشك كنيد. رسوب را با 8 ميلي ليتر آب يا بافر TE حل كنيد .
11- هضمDNA باآنزيم هاي محدودكننده (restriction digestion ) ( كارها روي يخ انجام گيرد):
هر يك ازآنزيمهاي محدودكننده ( برش دهنده ) ترادف خاصي را روي رشته DNA شناسايي كرده ودورشته DNA را برش ميدهند . آنزيمها ي محدود گر در مهندسي ژنتيك ازاهميت بالايي بر خوردارند و در حقيقت شبيه چاقوي جراحي براي مهندسان ژنتيك ميباشند ( به جدول آنزيمها مراجعه شود ).
1-. مقدار پلاسميد را تخمين بزنيد ( يك واحد آنزيم مقدار يك ميكرو گرم DNA را در حرارت مناسب در مدت يك ساعت هضم ميكندويك ميكروگرم DNA را در يك واكنشي به حجم 20-30 ميكروليتر با آنزيم هضم كنيد)
2- باآب مقطر حجم آن رابه 18 ميكرليتر ( يا هرحجم مورد نظر) برسانيد
3- لوله واكنش را spin كنيد
4- مقدار 2ميكروليتر از 10x Reaction buffer به واكنش اضافه كنيد(غلظت نهايي بافر 1x باشد)
5- با استفاده از سرسمپلر استريل و سرد مقدار آنزيم مورد نظر را به واكنش اضافه نماييد ( اين مقدار آنزيم بايد در حجم نهايي در نظر گرفته شده باشد).
6- با ضربه نوك انگشت واكنش را مخلوط كرده و سپس spin نماييد.
7- مدت يك تا دوساعت در حرارت مناسب انكوبه كنيد
مقدار 15 ميكروليتر از واكنش را با 3 ميكرو ليتر loading buffer مخلوط كرده و روي ژل آگارز با درصد مناسب الكتروفورزنماييد ( از Intact plasmid DNA بعنوان كنترل واكنش روي ژل دركنارنمونه الكتروفورز شود توجه : اگر DNA هضم نشده است آن را P.C.I extraction نموده و با الكل رسوب داده وواكنش را تكرار كنيد ).
جدول شماره 2 - قدرت جداسازي مولكولهاي DNA توسط غلظتهاي مختلف آگارز
12- تهيه ژل آگارز
1- قالب ژل را آماده كنيد
2- شانه اي با دنده هاي مناسب روي قالب قراردهيد
3- حجم ژل مورد نظر را تعيين كنيد ( اندازه گيري طول وعرض قالب و قطر ژل مورد نظر )
4- پودر آگارز را وزن كنيد
5- آگارز را در بافر 1xTBE حل كنيد و آن را حرارت داده تا خوب بجوشد و قبل از خنك شدن به ازاي هر 10 ميلي ليترژل يك ميكروليتر از محلول 10mg/ml اتيديوم برومايد اضافه كنيد سپس آن را خوب مخلوط كرده و داخل قالب بريزيد
1xTBE= 89mM Tris base, pH8, 89mM boric acid, 2.5mM EDTA, pH8
6- بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج كرده و داخل تانك الكتروفورز قرار دهيد
7- هر 5 ميكروليترنمونه را با يك ميكروليتر بافر نمونه مخلوط كرده و داخل چاهك هاي ژل بريزيد (اين بافر حاوي 50درصد ماده سنگين كننده مانند گليسرين يا ساكارز است كه نمونه بخوبي داخل چاهك ريخته ميشود و همچنين حاوي0.2 درصد از يك رنگ نشانه مانند بروموفنل بلو يا گزيلن سيانول ميباشد . رنگ برومو فنل بلودر ژل 1.5 درصد همراه با 500bp و درژل 0.8 درصد با 1000bpحركت ميكند )
جدول شماره 3 : مقايسه حركت رنگ نشانه و ماركر DNA روي ژل آگارز
جدول شماره 4 : مقايسه حركت رنگ نشانه و ماركر DNA روي ژل پلي آكريلا ميد
8.- بافر تانك بايد كاملا" روي ژل را بپوشاند و نمونه ها از داخل بافردرون چاهك ها ريخته شوند. (از بافرهاي مختلف استفاده ميگردد. بهتر است هنگام الكتروفورز به ازاي هر ميلي ليتر بافر تانك (TBE buffer) يك ميكرو ليتر از اتيديوم برومايد 10mg/ml اضافه شود.
9- DNA داراي شارژ منفي است و براي الكتروفورز شدن بايد نمونه بطرف قطب منفي با شد تا هنگام الكترو فورز به سمت قطب مثبت حركت كند
10- تانك الكتروفورز را به منبع تغذيه وصل كنيد
11- پيچ Current را روي ماكزيمم قرار داده و ولتاژ را تنظيم كنيد (10V/centimetr )
وقتي رنگ نشانه سه چهارم طول ژل را طي كرد ژل را از تانك خارج كرده بانورUV نتيجه را مشاهده كنيد .
13- تهيه ژل پلي آكريلاميد :
قدرت تفكيك سازي اين ژل بسيار بالا است و قطعات DNA با طول كم نيز در اين ژل قابل رويت ميباشند و بسته به در صد ژل حتي اختلاف يك باز را ميتوان در قطعات DNA الكتروفورز شده مشاهده نمود .
1. شيشه ها، شانه ( Comb ) و فضاسازها ( Spacer) را با آب و دترژان خوب بشوييد و سپس با الكل 70 در صد آنهارا تميز كنيد تا چربي دستها روي آنها باقي نماند ( بجاي پنبه از گاز استفاده كنيد زيرا پرزهاي پنبه روي شيشه باقي ميمانند ) .
2. قالب ژل را آماده كرده و جهت جلوگيري از نشت ژل ازداخل آن اطراف آن را با آگارز 1در صد به دقت درز گيري (Seal) نماييد .
3. حجم قالب (cast ) را ( حجم ژل) با اندازه گيري طول وعرض قالب مشخص نماييد ( قطر ژل بسته به قطر فضا سازها يك و يا نيم ميليمتر است )
4. بسته به در صدژل مورد نظر مقدار آكريلاميد و بيس آكريلاميد لازم را (بصورت مخلوط 29 در صد آكريلاميد و 1درصد بيس آكريلاميد تهيه و در يحچال نگهداري ميشود) داخل لوله تميز بريزيد
5. از بافر 10xTBE با غلظت نهايي 1x اضافه كنيد وبا آب مقطر به حجم مورد نظر برسانيد
6. مقدار 100 ميكرو ليتر آمونيوم پرسولفات 10درصد و 3 ميكرو ليتر محلول TEMED به آن اضافه كنيد ( توجه داشته باشيد كه مونومرهاي اكريلاميد وبيس آكريلاميد در حال پليمريزه شدن هستند)
7. به آرامي محلول را در قالب از قبل آماده شده بريزيد و مراقب باشيد كه حباب هوا وارد آن نشود زيرا حباب هوا مانع انجام الكترو فورز ميشود .
8. به آرامي شانه را داخل قالب قرار دهيد تا بعد از پليمريزه شده ژل ، درون آن چاهك هايي جهت نمونه گذاري ايجاد شود
9. بعد از پليمريزه شده به آرامي شانه را درآورده و چاهك هارا با آب بشوييد تا اگر مونومرهاي پليمريزه نشده هنوزوجود دارد شسته شوند
10. گيره پاييني را باز كنيد وفضاساز پاييني را از قالب خارج كنيد
11. گيره هاي طرفين را باز كرده و دستگاه را طوري داخل تانك مخصوص قرار دهيدكه قسمت بريده شده شيشه رويي ( Notch ) به سمت محفظه بالايي ( تانك فوقاني) قرار گيرد
12. شيشه هاي دستگاه ( قالب) را با نصب گيره ها ي مخصوص به طرفين تانك , ثابت نماييد
13. محفظه هاي بالا و پايين تانك را با 1xTBE buffer پرنماييد بطوريكه بافر روي چاهك ها را بپوشاند. چنانچه بين دوشيشه قالب ( محل خارج كردن فضاساز پاييني ) كه در محفظه پاييني تانك قرار دارد حباب هوا مشاهده ميشود با يك سرنگ پر از بافر كه دار اي سر سوزن كج است حباب هوا را بيرون كنيد تا مانع جريان الكتريكي نشود و الكترو فورز بخوبي انجام گيرد
14. محصول PCR را ( همانند الكتروفورز با ژل آگارز) با بافر نمونه گذاري مخلوط كرده و توسط سرنگ هاميلتون نمونه گذاري را روي ژل انجام دهيد
15. محفظه بالايي تانك را به قطب منفي ومحفظه پاييني را به قطب مثبت منبع تغذيه وصل كرده و الكتروفورز كنيد
16. بعد ازخاتمه الكتروفورز ( وقتي رنگ نشانه به پايين ژل رسيد) جريان برق را قطع كرده و شيشه را از تانك جدا كنيد. با يك تيغه فلزي نازك به آرامي بين دو شيشه فشار آوريد تا دو شيشه از هم جداشوند . ژل به يكي از دو شيشه مي چسبد . به آرامي آنرا داخل آب حاوي 10 ميكروگرم درهرميلي ليتر اتيديوم برومايد قرار دهيد تا بعد از چند دقيقه ژل رنگ شود .
ژل را روي دستگاه UV Transilluminator قرار داده و نوارهاي هاي DNA را مشاهده كنيد.
14-P.C.I extraction
هدف از اين كار حذف پروتئنهاي موجود در محلول حاوي DNA ميباشد . فنل ( equilibrated phenol با pH بيشتر از 7.5) موجب دناتوده شدن پروتئنها ميشود و كلرفرم نيز بقاياي فنل را از محلول واكنش حذف ميكند .
1- هم حجم محلول حاوي DNA فنل اضافه كنيد و مدت 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد ( فنل متعادل شده به علت 8-hydroxyquinoline ماده آنتي اكسيدان ) زرد رنگ است و روي آن با يك لايه بافر تريس پوشانيده شده است هنگام استفاده از فنل زير بافر استفاده كنيد)
2- مايع رويي ( مايع شفاف ) را به لوله تميز ديگري انتقال دهيد ( فنل در زير قرار ميگيرد و پروتئنهاي دناتوره شده بين دو لايه قرار ميگيرند).
3- هم حجم آن از مخلوط كلرفرم - ايزو آميل الكل ( 1:24) اضافه كنيد( ايزو آميل الكل يك ماده Anti foam است و مانع كف كردن محلول ميشود ) و مانند مرحله قبل ادامه دهيد
4- مايع رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد ويا مانند روش زير ميتوان عمل نمود:
5- مخلوط فنل - كلرفروم - ايزو آميل الكل (به نسبت 1:24:25) تهيه كنيد
6- حجم مساوي از مخلوط P.C.I به محلول حاوي DNA اضافه كنيد و 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد
7- محلول رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد و هم حجم آن C.I اضافه كنيد و 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد
8- محلول رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد (محلول حاوي DNA است )
9- اگر هنوز بوي فنل از آن متصاعد ميشود مرحله 7 را تكرار كنيد.
10- DNA را با الكل رسوب دهيد( تغليظ DNA ).
15- رسوب DNA با الكل ( تغليظ DNA )
هدف از اين كار احياي DNA بعد از استخراج و يا بعد از P.C.I. extraction ميباشد و در مواقعي نيز كه DNA خيلي رقيق باشد بدينوسيله آن را تغليظ ميكنيم.
1- حجم محلول حاوي DNA را تعيين كنيد ( تخمين بزنيد )
2- استات سديم با غلظت نهايي 0.3M به آن اضافه كنيد .
3.- مقدار دوبرابر حجم آن الكل مطلق سرد ( 20- يا 70-) اضافه كنيد
4- مدت 10 دقيقه با 12000xg سانتريفيوژ كنيد . رسوب سفيد رنگ را ميتوان در ته لوله مشاهده نمود ( لازم به ذكر است كه DNA خالص تقريبا" بيرنگ است ).
5- . با وارونه كردن لوله , مايع رويي را حذف كنيد و لوله را بصورت وارونه روي كاغذ جاذب الرطوبه قرار دهيد تا آب آن حذف شود .
6- مقدار 100 ميكرو ليتر الكل 70 درجه به آن اضافه كنيد و آن را ورتكس كنيد تا رسوب DNA از ته لوله كنده شده و شناور گردد ( اگر DNA بزرگ با شد ورتكس موجب شكسته شدن آن ميشود) .
7- مدت 5 دقيقه آن را سانتريفيوژ كنيد ( شستن DNA)
الكل را خالي كرده و DNA را در 70 درجه خشك كنيد ( چنانچه در اين مرحله DNA خوب خشك نشود والكل همراه آب داخل آن بماند بعدا" براي كار كردن با آنزيمها دچار اشكال ميشويد). DNA را در مقدار بافر ( آب ) دلخواه حل كنيد .
16- احياي DNA از ژل آگارز
هدف از اين قسمت كسب مهارت براي احياي DNA از روي ژل آگارز ميباشد. اين تكنيك در بيولوژي مولكولي و مهندسي ژنتيك اهميت زيادي دارد و در كلونينگ و انتقال ژن استفاده ميشود لازم به ذكر است كه از طرق مختلف اين كار انجام ميشود مانندFreez- Squeez, paper elution, Electero elution , و... ولي فقط دو روش توضيح داده ميشود :
الف ) احياي DNA ازروي ژل توسط كاغذ ( paper elution )
1- DNA مورد نظر رابا ژل آگارز 1-2درصد الكتروفورز كنيد و اجازه دهيد تانوارهاي هاي DNA بخوبي از همديگر تفكيك شوند
2- با نور UV ( طول موج 254 نانومتر موجب آسب DNA ميشود و بهتر است از طول موج 312 نانومتر استفاده گردد ) نوارهاي مورد نظر را مشاهده كرده و جلو آن را با تيغ اسكالپر تميز علامت گذاري كنيد
3- در جلو band يك حفره ايجاد كنيد ( عرض حفره مساوي عرض band باشد )
4- يك قطعه كاغذ واتمن و يك قطعه كيسه دياليز ( dialysis tubing ) به اندازه حفره ببريد
5.- كاغذ واتمن را در جلو حفره و كيسه دياليز را در پشت كاغذ قرار دهيد
6- الكترو فورز را ادامه دهيد ( بافر تانك را كمتر كنيد بطوري كه روي ژل را نپوشاند )
7- وقتي DNA وارد كاغذ شد الكترو فورز را متوقف كنيد
8.- كاغذ را جمع كرده و به لوله 5/ ميلي ليتري كه انتهاي آن سواخ شده است انتقال دهيد
9. توسط سمپلر مقدار مناسب با فر
(150mM NaCl , 20mM Tris (pH=7.5) 1mM EDTA , 5%SDS) روي كاغذ بريزيد
10- لوله مذكور را داخل يك لوله بزرگتر قرار دهيد ( 5/1 ميلي ليتر ) ، سانتريفيوژ كنيد تا مايع از ته لوله كوچك به داخل لوله بزرگتر حركت كند ، چند دفعه اينكار را تكرار كرده تا موقعي كه ديگر DNA روي كاغذ واتمن مشاهده نشود ( با نور UV آزمايش شود )
11- اين بافر را جمع آوري كرده و با P.C.I استخراج كرده و با الكل تغليظ كنيد
ب) احياي DNA از روي ژل آگارزLow Melting Point (LMP)
1- DNA مورد نظر را با آگارز LMP 2درصد الكترو فورز كنيد و اجازه دهيد تا نوارهاي DNA خوب تفكيك شوند
2- با نور UV ( طول موج 254 نانومتر موجب اسيب DNA ميشود و بهتر است از طول موج 312 نانومتر استفاده گردد ) band مورد نظر را مشاهده كنيد
3- band مورد نظر را با تيغ اسكالپر تميز علامت گذاري كنيد
4- ژل را روي كاغذ سفيد قرار داده و band مورد نظر را بريده به لوله تميرديگر منتقل كنيد
5- قطعه ژل را يك شب در فريزر 20- درجه قرار دهيد
6- قطعه ژل را در حرارت اتاق قرار دهيد و سپس 5 دقيقه در آب 65 درجه انكوبه كنيد
7-آن را به حرارت اتاق منتقل كرده و دو مرتبه با P.C.I استخراج كنيد تا ژل از آن حذف شود
8.- استات سديم ( غلظت نهايي 0.3M ) اضافه كرده با الكل رسوب دهيد
كلونينگ ( Cloning )
17- اتصال دو DNA به يكديگر در آزمايشگاه :
براي اتصال دو DNA به يكديگر در آزمايشگاه از آنزيم DNA ligase استفاده ميشود DNA ligase آنزيمي است كه بين دو نوكلئوتيد اتصال فسفودي استر ايجاد ميكند. دو نوع DNA ligase وجود دارد يكي T4 DNA ligase كه از فاژ T4 استخراج ميشود وانرژي لازم براي فعاليت خود را از ATP تامين ميكند اين آنزيم دوانتهاي blunt وهمچنين دوانتهاي Cohesive را بهم متصل كند( اتصال فسفودي استر ايجاد ميكند). ديگري DNA ligase باكتري E.coli كه انرژي لازم براي فعاليت خودراازNAD بدست مي آورد و بيشتر براي اتصال انتهاهاي Cohesive استفاده ميشود.
عمل Ligation طي سه مرحله انجام ميگيرد :
در مرحله اول گروه آدنيليل از ATP ) NAD ) به آنزيم متصل ميشود و زنجيره جانبي NH2 اسيد آمينه ليزين آدنيله ميشودو پيرو فسفات (با آنزيم T4 DNA ligase ) يا نيكو تيناميد (با آنزيم E.coli DNA ligase ) آزاد ميشود.در مرحله دوم گروه آدنيليل به انتهاي 5`-P متصل ميشود . در مرحله سوم اتصال فسفو دي استر بين گروه هيدروكسيل 3`- OH و گروه فسفوريل آدنيله شده 5` برقرار ميشودوAMP آزاد ميگردد.
منبع: http://www.iranbiotech.com
/س
1- باكتري بعنوان ميزبان
2- پلاسميد به عنوان حامل ژن
3- آنزيم بعنوان وسيله برش و اتصال قطعات DNA به يكديگر
ژنوتيپ باكتريها
F or F`( Fertility)) : اپي زومي كه پيلي جنسي ايجاد ميكند . قسمت هايي از كروموزوم E.coli مانند اپرون ( Lac - pro A) روي F` قرار دارد. براي آلوده كردن باكتري به فاژ M13 يا فاژ هاي كمكي ( M13K07 , R408 ) فاكتور F` لازم ميباشد. اين فاكتور براي توليد DNA تك رشته اي از فاژ( فارميد ) مفيد ميباشد .
ْْْْْْْْْْْْْْْْْhsd R - اين موتاسيون موجب كاهش خاصيت رستريكشن EcoK ميشود اما روي متيلاسيون تاثيري ندارد. باكتري كه داراي اين موتاسيون باشد DNA خارجي بدون اينكه توسط R.ENase نوع I هضم شود وارد آن ميشود.
hsd S باكتري كه داراي اين موتاسيون باشد فعاليت متيلاسيون و رستريكشن آن كاهش ميابند.
mcr- ( Methyl Cytosine Restriction) ) اين موتاسيون اختصاصا" روي هر دويا يكي ازسيستم هاي McrA و McrB تاثير ميكند. ژن McrA روي كروموزوم E.coli قرارداشته وكد كننده فعاليت Restriction - Methylation اختصاصي براي CmCGG ميباشد . ناحيه mcrB در روي كروموزوم حاوي دو ژن mcrB و mcrC است . محصول اين دو ژن موجب تشكيل نوكلئاز وابسته به هترو دايمر GTP ميشود. سومين فعاليت mcr بنام mcrF گفته ميشود( به mrr مراجعه شود ). اگر در Dcm تغييري ايجاد شده باشد با +Mcr هضم نميشود.
mrr- قسمتي از سيستم رستريكشن وابسته به متيلاسيون(MDRS) است . اين ژن DNA حاوي آدنين هاي متيله شده را هضم ميكند. ژن mrr روي ترادف هاي حاوي سيتوزين متيله( CpG) فعاليت Restriction دارد. اين فعاليت اشاره به mcrF ميباشد. اگر درDam , Dcm يا EcoK تغييري ايجاد شود DNA با Mrr مثبت ويا هرسيستم رستريكشن ديگر E.coli K12 هضم نميشود.
proA - اين موتاسيون فعاليت گاما گلوتاميل فسفات ردكتاز را كاهش ميدهدو بيوسنتز پرولين ناقص ميگردد. باكتري موتانت براي رشد خود به اسيد آمينه پرولين نياز دارد.
proB - اين موتاسيون موجب كاهش فعاليت آنزيم گاما گلوتامات كيناز شده وبه نقص بيوسنتز پرولين منجر ميشود . باكتري موتانت براي رشد خودبه اسيد آمينه پرولين نياز دارد.
ara A - درژن سيستم ال- آرابينوز ايزومراز باكتري موتاسيون رخ داده است و باكتري موتانت نميتواند از آرابينوز استفاده كند.
araC - در ژن رگولاتوري ( پروتئين اكتيواتور/ رپرسور ) موتاسيون رخ داده است
galK - (galA) ژن ساختماني گالاكتوكيناز است. باكتريهاي موتانت نمي توانند گالاكتوز را مصرف كنند. اين موتانتها از گالاكتوز Expression Vector استفاده ميكنند.
LacY- اين موتاسيون موجب كاهش فعاليت گالاكتوز پرمئاز ( پروتئين M ) ميشود و باكتري نميتواند از لاكتوز استفاده كند .
recAI- اين موتاسيون موجب كاهش نو تركيبي هومولوگ و افزايش پايداري DNA كلون شده ميگردد. رشد اين سويه ها كند است و كارآيي ترانسفر ماسيون آنها پايين است.
rpsL- درژن زير واحد S12 ريبوزوم 30S موتاسيون ايجاد ميشود كه موجب مقاومت به استرپتومايسين ميشود. اين ژن بصورت StrA هم نوشته ميشود.
e14- اپي زوم شماره 14 حاوي ژن mcrA1 ميباشد و حذف آن موجب صفت McrA منفي در باكتري ميشود. حذف e14 منجر به آللهاي ديگر McrA ميشود.
supE44- اين موتاسيون موجب ميشود كه به جاي UAG كه كدون متوقف كننده است اسيد آمينه Gln در زنجيره پپتيدي قرار بگيرد. اين سويه ها حاوي ژن (gln V ) براي گلوتامين tRNA2 ميباشند كه براي رشد فاژها لازم ميباشند.
xyLA - موتاسيوني كه درD- گزيلوز ايزومراز ايجاد ميشودوباكتري موتانت نمي تواند گريلوز را مصرف كند.
LacIq- ايجاد موتاسيون در پروموتور i ( ژن رپرسور ) كه منجر به توليد 10 برابر رپرسور لاكتوز ميشود. اين موتان براي توقف بيان ( اكسپرس ) ژن از طريق پروموتور لاكتوز مفيد ميباشد.
amber codon - كدون UAG كه متوقف كننده ( Termination ) سنتز پروتئين است بنام آمبر كدون گفته ميشود.
Tn10- ترانسپوزوني كه موجب مقاومت به تتراسيكلين ميشود ( Tetr) .
endA -اين موتاسيون بصورت غير اختصاصي DNA endonuclease I را غير فعال ميكند . اين موتاسيون براي جدا كردن پلاسميد DNA مفيد ميباشد و كيفيت آن را بهبود مي بخشد.
gyrA96 -موتاسيون درژن زير واحدA آنزيم DNA gyrase ايجاد ميشود و باكتري به ناليديكسيك اسيد مقاوم ميگردد.
thi I(thi A)- موتاسيون درژن سنتز تيازول ايجادشده است وبراي رشد باكتري تيامين ( ويتامين B123 ) با منشاء خارجي نياز ميباشد.
supE - باكتري موتانت كدون UAG ( كدون ختم زنجيره ) را بعنوان كدون گلوتامين شناسايي ميكند. هنگام سنتز پروتئين وقتي با UAG مواجه شود اسيد آمينه گلوتامين وارد زنجيره پلي پپتيدي ميشود. كدون UAG بصورت عادي يك كدون متوقف كننده است .وكتور M13 براي كدون UAG درچندين ژن موجوددر ژنوم فاژ طراحي شده بود اين وكتورها فقط درسويه هاي آزمايشگاهي ذرات فاژ توليدميكردند. ژن آنها بطورصحيح در باكتري هاي سويه وحشي ترجمه نميشد (مانند باكتريهايي كه در روده زندگي ميكنند) وقادربه رشددرمحيط خارج از آزمايشگاه نبودند. اين ايده موجب جلوگيري از آزادكردن باكتريهاي مهندسي شده درمحيط گرديد.
F`[traD36]- ژن TraD درانتقالDNA ازطريق كنژوگاسيون دخالت دا (Fertility plasmid ) . ژن موتاسيون يافته ازكنژوگاسيون باكتري جلوگيري ميكند. پلاسميد هاي F` هنگام كنژوگاسيون از يك سلول به سلول ديگر منتقل ميشوند و يك پلاسميد مهندسي شده ميتواند به يك باكتري وحشي منتقل شود ( يعني باكتري ترانسفرم شده از پتري ديش خارج شود ). موتاسيون traD36 با كاهش پديده كنژوگاسيون يك نوع ايمني ميباشد كه از ايجاد حادثه جلوگيري ميكند.
F`[ proAB+] - اين موتاسيون موجب حذف ژنهاي بيوسنتز پرولين از باكتري شده واين ژنها در پلاسميد F` مستقر شده اند. بنا براين باكتري ميتواند پرولين را سنتز كند و احتياجي به اضافه نمودن پرولين به محيط كشت نميباشد ( تا زماني كه باكتري پلاسميد F` داشته باشد ). اگر باكتري پلاسميد F` خود را از دست بدهد ( مثلا" وقتي باكتري مدت زيادي در كشت آگار نگهداري شود ) به proAB منفي تبديل ميشود و باكتزي فقط در حضور پرولين رشد ميكند. اگرباكتري پلاسميد F` خود را از دست بدهد مدت زيادي نميتواند پيلي جنسي بسازد وبا فاژ M13 آلوده نميشود. بنا برا ين كشت باكتري در محيط minimum كه فاقد پرولين است انجام ميگيرد و به اين معني است كه فقط سلولهايي كه پلاسميد F` دارند و به M13 آلوده ميشوند ميتوانند زنده بمانند.
F`[LacZΔM15] - lacZ ژن بتا گالاكتوزيداز است . ΔM15 يعني اين نسخه از ژن LacZ فاقد كدونهاي 41-11 است . كدونهاي 41-11 مخصوص قسمتي از پروتئين LacZ هستند كه بنام پپتيد آلفا گفته ميشود. در غياب اين پپتيد آنزيم بتا گالاكتوزيداز ناقص است ( براي فعاليت آنزيم ، سلول بايد داراي ژن LacZ` باشد كه براي Missing peptide كد شود) . ژن LacZ` روي وكتور است وسلولهاي حاوي اين وكتورها ميتوانند ژن بتا گالاكتوزيداز كامل توليد كنند، بنا بر اين وكتور و سلول با همديگر در پديده Lac selection همكاري دارند.
نقش ژن LacZ- اين ژن ماركر انتخابي با كتري نوتركيب ميباشد و 140 اسيد آمينه آنزيم بتا گالاكتوزيدازباكتري E.coli را كد ميكند . ژن مذكورلاكتوزرا به گلوكز و گالاكتوز تبديل ميكند. پروتئيني كه توسط LacZكد ميشود به تنهايي براي تبديل لاكتوز به گلوكز و گالاكتوز كافي نيست و با يك قطعه ثانوي كه حاوي بقيه پروتئين بتا گالاكتوزيداز است كامل ميشود و آنزيم فعال توليد ميكند. اين پپتيد ثانويه توسط وكتور (براي ترانسفر ماسيون در آزمايش كلونينگ استفاده ميشود ) سنتز ميشود . واكنش ترانسفرماسيون باكتري با وكتورحاملLacZ` روي پليت آگار حاوي ) X-gal 5- برومو، 4 -كلرو، 3 - ايندوليل - بتا گالاكتوپيرانوزيد ) كه آنالوگ لاكتوز است پخش ميشود.
سيستم Lac selection بصورت زير كار ميكند: (Lac Operon)
سلولي كه حاوي وكتور كلونينگ با يك ژن LacZ` بكر ( دست نخورده ) است ميتواند بتا گالاكتوزيداز را سنتز كند اين آنزيم همراه با IPTG كه يك القا كننده است X-gal را به تركيب آبي رنگ برومو كلرو ايندوليل تبديل ميكند . اين سلولها كلني آبي رنگ (فقط حاوي پلاسميد هستند ) يا پلاك آبي رنگ ( حاوي فاژ ) توليد ميكنند. سلولهاي نوتركيبي كه ژن LacZ` آنها توسط Inserted DNA تخريب شده است نميتوانند بتا گالاكتو زيداز را سنتز كنند و كلني هاي سفيد يا پلاك هاي شفاف توليد ميكنند
- بافر هاي مورد نياز در آزمايشگاه بيولوژي مولكولي
اولين وظيفه فرد در آزمايشگاه مولكولار بيولوژي تهيه بافر هاي مورد نياز ميباشد. همه واكنشهاي بيولوژي در بافر مخصوص انجام ميشوند . معمولا"مواد اصلي بافر هارا در آزمايشگاه بصورت ذخيره ((Stock تهيه ميكنند و بافر هاي مورد نياز روزانه را از مواد ذخيره تهيه مينمايند . بعضي از مواد ذخيره و مولاريته آنهابه اين شرح است:
نام ماده | مولاريته ( غلظت ) | نام ماده | مولاريته ( غلظت) |
Ammonium Acetate | 10M | NaCl | 5M |
Tris pH ( 8, 7.5 , 7.4) | 1M | CaCl2 | 1M |
NaOH | 5N | EDTA | 0.5M |
Ethidium bromide | 1mg/ml | SDS | 10% |
X-gal | 20mg/ml | KAc | 5M |
IPTG | 200mg/ml | NaAc | 3M |
براي تهيه محلول كار از مواد ذخيره از فرمول زير استفاده ميشود
M1V1=M2V2
M1 مولاريته ماده ذخيره V1حجم ماده ذخيره كه بايد براي بافر برداشته شود
M2مولاريته بافر موردنياز V2حجم بافرخواسته شده
مثلا" براي تهيه 50 ميلي ليتر TE بافر ( 10 ميلي مولار تريس و 1ميلي مولار EDTA ) چنين عمل ميكنيم :
50x10 = ?x1000, 500:1000= 0.5cc ( 500 μl) Tris
50x1 = ? x500 , 50:500 = 0.1cc ( 100μl ) EDTA
روش كار: 500μl از بافر تريس و 100μl از EDTA را درظرف مدرج ( لوله فالكن ) ريخته و حجم آن را به 50ml ميرسانيم .
3- تهيه محيط LB brothبراي كشت باكتري ( E.coli )
هدف از آموزش اين قسمت تهيه محيط مايع براي كشت با كتريهاي مورد استفاده در كار هاي بيولوژي مولكولي ميباشد
1- مواد زير را وزن كرده درون ارلن ماير ريخته و روي Stirrer مخلوط كنيد
تريپتون 5/2 گرم سديم كلرايد5/2 گرم
عصاره مخمر25/1 گرم آب مقطر250 ميلي ليتر
2- pH محيط را مساوي 5/7-7 تنظيم كنيد و سپس آن را اتوكلاو نماييد. مقدار لازم از آن را درون لوله مناسب ريخته ( در صورت نياز آنتي بيوتيك مناسب به آن اضافه نماييد ) و بصورت استريل ( كنار شعله ) يك كلني از سلول مورد نظر را درآن كشت داده ويك شب در 37 درجه آن را Shake كنيد.
4- تهيه آگار پليت
هدف از انجام اين كار تهيه محيط كشت جامد براي كشت باكتريها ميباشد. به محيط LB مقدار 5/1 درصد وزني پودر آگارآگار اضافه كرده وروي شعله قرار دهيد تا خوب بجوشد تا آگار كاملا" حل شده ومحلول شفاف بدست آيد سپس آن را اتوكلاو كنيد.مقدار 100μg / ml آمپي سيلين ( يا هر آنتي بيوتيك مناسب ديگر ) به آن اضافه كنيد.محيط را داخل چند پليت تقسيم كرده و در حرارت اتاق قرار داده تا آگار سفت شود سپس آنها را لاي كاغذ پيچيده و تا هنگام استفاده دربرودت 4 درجه نگهداري نماييد.
اطلاعات بيشتر
5- تهيه آنتي بيوتيك هاي مورد نياز كارگاه :
الف ) 500mg آمپي سيلين ( يك ويال) رادر 5 سي سي آب مقطراستريل حل كنيد غلظت آن100mg/ml است و هر ميكرو ليتر اين محلول حاوي 100μg آمپي سيلين است .آمپي سيلين با غلظت نهايي 100μg/ml مصرف ميشود. براي هر ميلي ليتر محيط كشت ( LB broth يا آگار پليت ) يك ميكروليتر از اين محلول استفاده ميشود.ب) تتراسيكلين ( ويال يا كپسول ) را با غلظت 25mg/ml در متانول حل كنيد و در لوله هاي يك ميلي ليتري تقسيم كرده فريزر كنيد. اين آنتي بيو تيك با غلظت نهايي 12.5μg/ml مصرف ميشود . براي هر ميلي ليتر محيط كشت( LB broth يا آگار پليت ) 0.5 ميكروليتر از اين محلول استفاده ميشود ( ميتوان محلول ذخيره تتراسيكلين را با غلظت 12.5mg/ml تهيه نمود سپس براي هر ميلي ليتر محيط يك ميكروليتر از ملول ذخيره اضافه نمود).
6- تهيه سلول پذيرا ( Competent cell )
هدف ازآموزش اين قسمت كسب مهارت براي تهيه سلول باكتري است بطوري كه طي پروسه اي كه روي آن انجام ميگيرد باكتري زنده بماند و پلاسميد (Circular DNA ) بتواند وارد آن شود. سرما وكلسيم كلرايد و متعاقب آن شوك گرمايي ( Heat shock) كه به سلول وارد ميشود تغييراتي در سطح سلول ايجاد ميشود وDNA پلاسميدي از طريق مناقذي كه روي سطح سلول ابجاد شده اند وارد آن ميگردد.
روش كار:
1- يك كلني از باكتري مورد نظر را در 3 ميلي ليتر محيط LB كشت داده ويك شب در 37 درجه روي شيكرانكوبه كنيد
2. يك حجم از كشت شبانه باكتري مورد نظر رادر ده حجم محيط LB كشت دهيد ( بنا به دلايلي كه بعدا" توضيح داده ميشود در اين كارگاهها از دو سويه HB101 و XL1-blue باكتري E.coli كه خصوصيات آنها نيز توضيح داده خواهد شد استفاده ميگردد)
3. مدت2.5ساعت در حرارت و rpm مناسب آن را Shake كنيد تا به OD600 = 0.6 برسد
4. مقدار يك ميلي ليتر آن را به لوله ميكروفيوژ انتقال دهيد
5. لوله حاوي سلول را ده دقيقه روي يخ قرار دهيد
6. مدت 5 دقيقه با 3500rpm سانتريفيوژ كنيد ( بهتر است در 4درجه انجام شود )
7. مايع رويي را خالي كرده ولوله را وارونه روي كاغذ جاذب الرطوبه قرار دهيد تا آب آن خارج شود
8. رسوب را بايك سوم حجم اوليه از محلول 100mM CaCl2 سوسپانسيون كنيد ( محلول نبايد ورتكس شود بلكه با ضربه انگشت آن را حل كنيد) و ده دقيقه روي يخ قرار دهيد
9. مانند مرحله 5 آن را سانتريفيوژ كرده محلو ل رويي را خالي كنيد
10. رسوب را با يك دوازده ونيم حجم اوليه محلول CaCl2 سوسپانسيون كنيد ( با ضربه دست )
آن را درون ميكروفيوژ هاي مناسب تقسيم كرده وبراي Transformation استفاده كنيد.
7- Transformation ( انتقال Plasmid DNA به باكتري زنده )
هدف از آموزش اين قسمت كسب مهارت لازم براي انتقال پلاسميد به سلول باكتري ميباشد . اين كار در بيولوژي مولكولي از اهميت بالايي بر خوردار است . براي كار كردن با ژنها بايد حتما" آن ژن در يك پلاسميد كلون شود و سپس پلاسميد نوتركيب (Recombinant plasmid) به سلول باكتري منقل شود تاپس از همانند سازي پلاسميد، ژن ( DNA ) كلون شده در پلاسميد نيز به تبع آن همانند سازي كند .
1. سلول پذيرا ( Competent cell ) را روي يخ قرار دهيد
2. Plasmid DNA مورد نظر را (5ng) به آن اضافه كرده خوب مخلوط كنيد ( بنا به دلايلي كه بعدا" توضيح داده ميشود دراين كارگاهها از دوپلاسميد pBR322 وBluescript كه خصوصيات آنها نيز توضيح داده خواهد شد استفاده ميگردد)
3. - لوله حاوي سلول پذيرا ( Competent cell ) را مدت 30 دقيقه روي يخ قرار دهيد
4.- واكنش را مدت 40 ثانيه در آب گرم 42 درجه قرار دهيد ( شوك گرما )
5.- مدت 2-1 دقيقه روي يخ قرار دهيد
6-. مقدار 200 ميكروليتر محيط LB ( بدون آنتي بيوتيك) به آن ضافه كرده و 60-40 دقيقه در 37 درجه انكوبه كنيد (باكتر ي E.coli هر 20 دقيقه يك نسل تكثير ميكند ودر اينجا به آن فرصت داده ميشود تا دو يا سه نسل تكثيرنمايد ) . .
7- بصورت زير روي آگار پليت پخش كنيد ( توجه : همه محتواي لوله را روي پليت خالي كرده و با Spreader آن را روي سطح آگار داخل پليت پخش كنيد):
پليتA : Competent cell+ plasmid DNA و آنتي بيوتيك مناسب
پليت: B Competent cell ( آگار حاوي آنتي بيوتيك است )
پليتC : Competent cell ( آگار فاقد آنتي بيوتيك است )
8.- پليت را به انكوباتور منقل كرده ودرب آنها را نيمه باز بگذاريد تاسطح پليتها خشك شود
9- . پليت هارا بصورت وارونه يك شب در حرارت 37 درجه انكوبه كنيد
10- اگر پروسه كار خوب انجام شده باشد بعد از 12 ساعت روي سطح پليت كلني ها ظاهر ميشوند
11- تفسير نتايج : اگر كار درست انجام شده باشد بايد روي پليت هاي A و C كلني باكتري رشد كرده باشد ولي روي پليت B كلني باكتري مشاهده نگردد رشد كلني باكتريايي روي پليت B به اين معني است كه باكتري مورد استفاده قبلا"با يك پلاسميد حاوي ژن مقاومت به آنتي بيوتيك ترانسفرم شده است در اينصورت كلني هايي كه روي پليت A ظاهر شده اند فاقد اعتبار ميباشند . اگر روي پليت C كلني با كتر ي رشد نكند به اين معني است كه Competent cell خراب بوده و باكتريها در طول پروسه كار مرده اندو نبايد انتظار داشته با شيم كه روي پليت A هم كلني باكتري رشد كند .كلني هاي باكتريايي كه روي پليت A رشد ميكنند كلني هاي حاوي پلاسميد مورد نظر هستند.
8- پلاسميد ها :
پلاسميد يك مولكول dsDNA حلقوي است كه وارد باكتري ميشود و همانند سازي آن داخل سيتوپلاسم باكتري وبطورمستقل از ژنوم باكتري انجام ميگيردوبه آساني هم از باكتري استخراج ميشود. هرپلاسميد داراي يك(ori) Origin of Replication ( منشاء همانند سازي ) است كه همانند سازي پلاسميد از آن نقطه شروع ميشود . قسمتي از ترادف پلاسميد كه براي تعدادي از Restriction enzyme ها فقط يك جايگاه برش دارد و اين آنزيم ها در قسمتهاي ديگرترادف پلاسميد جايگاه برش ندارند Multiple Cloning Site گفته ميشود وبراي تهيه Recombinant DNA از آن استفاده ميشود يعني مولكول DNA خارجي در اين قسمت كلون ( Clone ) ميگردد.تعدادي از پلاسميد ها در طبيعت يافت ميشوند (در باكتريها و مخمرها ) ولي در مقايسه با كروموزوم سلول ميزبان بسيار كوچكتر مي باشند و اغلب در خارج كروموزوم باكتري ديده ميشوند.( تعدادي از پلاسميد ها براي كارهاي خاصي در آزمايشگاه طراحي و ساخته شده اند ). اگر چه پلاسميدها براي زندگي سلول باكتري ضروري نيستند ولي حاوي ژن مقاومت به يك آنتي بيوتيك ميباشند كه براي كارهاي مهندسي ژنتيك لازم و ضروري است. بعضي از پلاسميدها تعداد زيادي كپي در داخل سلول باكتري دارند كه بنام High copy number plasmid گفته ميشوند(همانند سازي اين پلاسميد ها به كروموزوم باكتري بستگي ندارد) و Relaxed Plasmid هم گفته ميشوند . تعداد ديگري ازپلاسميدها تعداد كپي محدود تري در داخل سلول باكتري ايجاد ميكنند كه بنام Low copy number plasmid معروف هستند و باكتري شديدا" Replication آنها را كنترل ميكند و به Stringent Plasmid هم معروف ميباشند. با تغييراتي كه در Sequence پلاسميد ها ايجاد ميكنند صفات خاصي در آنها بوجود مي آيد كه در مهندسي ژننتيك استفاده ميشوند .چنانچه ori دو پلاسميد از يك منشا باشند هنگام ترانسفورماسيون با هم رقابت كرده و فقط يكي از آنها وارد باكتري ميشود اما اگر منشا ori انها با هم اختلاف داشته باشد هنگام ترانسفور ماسيون دو پلاسميد نيز ميتوانند وارد يك سلول بشوند ( اين مسئله در كارهاي كلونينگ اهميت خاصي دارد ).كارهاي عملي در اين كار گاههاي آموزشي با دو پلاسميد انجام ميگيرد:
الف) پلاسميد pBR322 اين پلاسميد توسط فرانسيسكو بوليوار و همكاران طراحي و ساخته شده است و همه خصوصيات يك پلاسميد خوب را دارا ميباشد . وزن مولكولي پايين (4363bp ) دارد و براي تعدادي از Restiction Enzyme ها فقط يك جايگاه برش دارد . اين پلاسميد داراي دوژن مقاومت به آمپي سيلين و تترا سيكلين ميباشد و هنگاميكه وارد باكتري ميشود باكتري نسبت به دو آنتي بيوتيك مذكور مقاوم ميشود.قسمتي از ترادف اين پلاسميد (705bp ) را كه براي ادامه زندگي آن ضروري نميباشد با آنزيم HaeII برش داده و حذف كرده اند واز آن پلاسميدي بنام pT153 ساخته اند كه همانند سازي آن 5-3 برابر پلاسميد PBR322 ميباشد ب) پلاسميد Bluescript sk همانطور كه در شكل ديده ميشود ترادف ژن Lacz` ( قسمتN terminal ژن β-galactosidase ) بطوري روي پلاسميد تعبيه شده است كه Multiple Cloning Site اين پلاسميد قسمتي از ترادف ژن مذكور ميباشد. (جايگاه برش آنزيمها درقسمت هاي مختلف ترادف پلاسميد PBR322 قرار دارند ) كه درمهندسي ژنتيك براي انتخاب كلني هاي سفيد باكتريايي حاوي Recombinant DNA استفاده ميشود. در دو طرف MCS اين پلاسميد پروموتور فاژهاي T3 و T7 قرار داشته كه ژن كلون شده را بر حسب Orientation آن ميتوان توسط هر يك از پروموتورهاي مذكور بيان ( Express) نمود . اين پلاسميد داراي دو Original of Replication است كه يكي از باكتري E.coli و ديگري از فاژ F1 گرفته شده است كه به اين علت فاژميد هم گفته ميشود.. اين پلاسميد براي توليد ssDNA هنگام Sequencing يك قطعه DNA هم قابل استفاده ميباشد. در Bluescript sk (M13) جايگاه آنزيم SacI بلافاصله در Downstream پروموتور فاژ T7 و جايگاه آنزيم KpnI بلافاصله در Downstream پروموتورفاژ T3 قراردارند. پلي كلونينگ سايت Bluescript ks (M13)) در orientation مخالف پلاسميد Bluescript sk (M13-) قرار گرفته است.
9- استخراج پلاسميد در مقياس كم ( Minipreparation )
هدف از آموزش اين قسمت كسب مهارت براي استحراج پلاسميد از داخل باكتري ميباشد و همانطوريكه قبلا" گفته شد اين كار در مهندسي ژنتيك و بيولوژي مولكولي از اهميت بالايي برخوردار است. استخراج Plasmid DNA با روش آلكالين وبه صورت Miniprep در موارد Colony screening استفاده ميشود و براي كارهاي حساس تر پلاسميد بصورت Large scale استخراج ميگردد. ( دراين كارگاه فقط Miniprep انحام ميشود). براي استخراج پلاسميد سلول باكتري با محلول GTE ( گلوكز، تريس ، EDTA ) ليز شده و محتويات آن آزاد ميشوند . Genomic DNA و پروتئينهاي سلولي را با محلول قليا ( NaOHو SDS ) دناتوره كرده(در اين روش DNA سوپر كويل دناتوره نميشود) و بلافاصله با اسيدي كردن محيط و ايحاد سرما Genomic DNA و پروتئينهارا رسوب ميدهيم. در اين پروسه Plasmid DNA بصورت محلول باقي ميماندكه توسط سانتريفيوژآنرا از فازآلي ( پروتئين ها ) جدا ميكنيم .
روش كار:
1- مقدار 5/1 ميلي ليتر كشت شبانه ( باكتري حاوي پلاسميد) را بمدت5 دقيقه با 4500rpm سانتريفيوژ كنيد . عده اي معتقدند چنانچه رسوب را با محلول STE سوسپانسيون كرده و دوباره سانتريفيوژ كنيم ( شستشو دهيم ) واكنش هاي آنزيمي بهتر انجام ميشود
[ STE = 100mM NaCl , 10 mMTris ( pH=8) , 1mM EDTA (pH=8)]
2- رسوب را در 100μl محلول I سوسپانسيون ( محلول روي يخ سرد شده باشد )
محلول I : 50mM glucose , 25mm Tris , 10 mM EDTA (pH 8)
3-. ميكرو فيوژ حاوي واكنش را مدت 10-5 دقيقه در هواي اتاق قرار دهيد
4.- مقدار 200μl از محلول II تازه تهيه شده به لوله واكنش اضافه كرده ، درب لوله را ببنديد و با وارونه كردن آن محلول را خوب مخلوط كنيدو 5 دقيقه روي يخ قرار دهيد.
محلول II : 0.2N NaOH, 1% SDS
5- مقدار 150μl از محلول III (سردشده روي يخ ) به لوله واكنش اضافه كنيد . درب لوله را بسته و به آهستگي 10 دفعه آن را وارونه كنيد ومدت 15 دقيقه روي يخ قرار دهيد.
محلول III : 60 ميلي ليتر 5M AcoK , اسيد استيك 5/11 ميلي لير, آب مقطر5/28 ميلي ليتر ( اين محلول داراي 3مولار پتاسيم و 5 مولار استات است ) وقتي اين محلولبه واكنش اضافه ميشود بايد يك رسوب سفيد رنگ در داخل لوله پديدار گردد .
6- مدت 20 دقيقه با 12000xg آن را سانتريفيوژ كنيد
7- محلول رويي (تقريبا" 450 ميكرو ليتر ) را به لوله ديگر انتقال دهيد( حاوي پلاسميد ميباشد)
8- سديم استات با غلظت نهايي 0.3M به آن اضافه كنيد ( عده اي اين مرحله راضروري نميدانند )
9- دو برابر حجم آن اتانل مطلق سرد اضافه كنيد
10- مدت 15 دقيقه آن را سانتريفيوژ كنيد تا plasmid DNA رسوب كند . الكل را حذف كنيد ( حتما" لوله را وارونه روي كاغذجاذب الرطوبه قرار دهيد ).
11- روي رسوب الكل 70درجه ( 100 ميكرليتر) اضافه كنيد و آن را ورتكس كنيد بطوريكه pellet كنده شده و در الكل شناور شود
12- مدت 3دقيقه در حرارت اتاق آن را سانتريفيوژ كنيد ( شستشو دادن با الكل )
13- الكل را خالي كرده ورسوب را در حرارت 70 درجه خشك كنيد .
14- رسوب را در 50 ميكروليتر آب يا بافر TE )) حل كنيد
TE= 10mM Tris pH 8 , 1mM EDTA pH 8
10- استخراج پلاسميد در مقياس بالا (Large scale Plasmid DNA preparation) :
1. مقدار 500 ميلي ليتركشت شبانه را با 4000g به مدت 10 دقيقه سانتريفيوژ كنيد. مايع رويي را خالي كرده و لوله را وارونه روي كاغذ خشك كن قرار دهيد تا درناژشود. رسوب را با STE سوسپانسيون نموده و دو بار ه سانتزيفيوژ كنيدو سپس لوله وارونه قرار داده تا درناژ شود.
[ STE = 100mM NaCl , 10 mMTris- base ( pH=8) , 1mM EDTA (pH=8)]
2. رسوب را در10 ميلي ليتر محلول I حل كنيد.
Solution I: 50 mM glucose , 25 mM Tris ( pH 8), 10 mMEDTA
3. آن را خوب سوسپانسيون كنيد و 10 دقيقه در هواي اتاق قرار دهيد
4. مقدار 20 ميلي ليتر از محلول II تازه تهيه شده به آن اضافه كرده درب لوله را ببنديد و با وارونه كرده آن محلول را خوب مخلوط كنيدو 5 دقيقه روي يخ قرار دهيدمحلول
Solution II: 0.2N NaOH, 1% SDS
5. مقدار 15 ميلي ليتر از محلول III به به واكنش اضافه كنيد و15 دقيقه لوله را روي يخ قرار دهيد
Solution III : 60 ml of 5M ACOK , 11.5 ml of Acetic Acid , 28.5 ml of ddH2O
( اين محلول داراي 3مولار پتاسيم و 5 مولار استات است ) وقتي اين محلول اضافه ميشود بايد يك رسوب سفيد رنگ پديدار گردد ( ميتوان باپروخالي كردن محلول توسط پيپت پروتئينها را شكست )
6. مدت 20 دقيقه با 20000xg آن را سانتريفيوژ كنيد
7. محلول رويي ر ا (تقريبا" مقدار 15 ميلي ليتر) به لوله جديد انتقال دهيد
8. مقدار0.6 حجم اوليه ( 12 ميلي ليتر ) ايزو پروپانل به آن اضافه كنيد وخوب مخلوط كرده و 15 دقيقه در حرارت اتاق قرار دهيد
9. درحرارت اتاق و مدت 15 دقيقه آن را سانتريفيوژ كنيد تا plasmid DNA در ته لوله رسوب كند ( توجه : اگر در 4 درجه انجام شود نمك ها رسوب ميكنند )
مايع رويي را حذف كنيد ( حتما" لوله را وارونه قرار دهيد ) و رسوب رابا الكل 70درجه و در حرارت اتاق شستشو دهيد ( مقدار 10 ميلي ليتر الكل 70 درجه به هر لوله اضافه كرده و با 17000g بمد ت 10 دقيقه سانتريفيوژ كنيد ). الكل را خالي كرده و آن را در حرارت 70 درجه خشك كنيد. رسوب را با 8 ميلي ليتر آب يا بافر TE حل كنيد .
11- هضمDNA باآنزيم هاي محدودكننده (restriction digestion ) ( كارها روي يخ انجام گيرد):
هر يك ازآنزيمهاي محدودكننده ( برش دهنده ) ترادف خاصي را روي رشته DNA شناسايي كرده ودورشته DNA را برش ميدهند . آنزيمها ي محدود گر در مهندسي ژنتيك ازاهميت بالايي بر خوردارند و در حقيقت شبيه چاقوي جراحي براي مهندسان ژنتيك ميباشند ( به جدول آنزيمها مراجعه شود ).
1-. مقدار پلاسميد را تخمين بزنيد ( يك واحد آنزيم مقدار يك ميكرو گرم DNA را در حرارت مناسب در مدت يك ساعت هضم ميكندويك ميكروگرم DNA را در يك واكنشي به حجم 20-30 ميكروليتر با آنزيم هضم كنيد)
2- باآب مقطر حجم آن رابه 18 ميكرليتر ( يا هرحجم مورد نظر) برسانيد
3- لوله واكنش را spin كنيد
4- مقدار 2ميكروليتر از 10x Reaction buffer به واكنش اضافه كنيد(غلظت نهايي بافر 1x باشد)
5- با استفاده از سرسمپلر استريل و سرد مقدار آنزيم مورد نظر را به واكنش اضافه نماييد ( اين مقدار آنزيم بايد در حجم نهايي در نظر گرفته شده باشد).
6- با ضربه نوك انگشت واكنش را مخلوط كرده و سپس spin نماييد.
7- مدت يك تا دوساعت در حرارت مناسب انكوبه كنيد
مقدار 15 ميكروليتر از واكنش را با 3 ميكرو ليتر loading buffer مخلوط كرده و روي ژل آگارز با درصد مناسب الكتروفورزنماييد ( از Intact plasmid DNA بعنوان كنترل واكنش روي ژل دركنارنمونه الكتروفورز شود توجه : اگر DNA هضم نشده است آن را P.C.I extraction نموده و با الكل رسوب داده وواكنش را تكرار كنيد ).
الكتروفورز DNA
جدول شماره 2 - قدرت جداسازي مولكولهاي DNA توسط غلظتهاي مختلف آگارز
درصد آگارز | قدرت جداسازي DNA |
3 | 100-1000bp |
2 | 200- 1500bp |
1.5 | 300- 3000bp |
1 | 500 – 5000bp |
0.8 | 1000- 7000bp |
0.6 | 10 – 30kbp |
0.4 | 30 – 50kbp |
1- قالب ژل را آماده كنيد
2- شانه اي با دنده هاي مناسب روي قالب قراردهيد
3- حجم ژل مورد نظر را تعيين كنيد ( اندازه گيري طول وعرض قالب و قطر ژل مورد نظر )
4- پودر آگارز را وزن كنيد
5- آگارز را در بافر 1xTBE حل كنيد و آن را حرارت داده تا خوب بجوشد و قبل از خنك شدن به ازاي هر 10 ميلي ليترژل يك ميكروليتر از محلول 10mg/ml اتيديوم برومايد اضافه كنيد سپس آن را خوب مخلوط كرده و داخل قالب بريزيد
1xTBE= 89mM Tris base, pH8, 89mM boric acid, 2.5mM EDTA, pH8
6- بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج كرده و داخل تانك الكتروفورز قرار دهيد
7- هر 5 ميكروليترنمونه را با يك ميكروليتر بافر نمونه مخلوط كرده و داخل چاهك هاي ژل بريزيد (اين بافر حاوي 50درصد ماده سنگين كننده مانند گليسرين يا ساكارز است كه نمونه بخوبي داخل چاهك ريخته ميشود و همچنين حاوي0.2 درصد از يك رنگ نشانه مانند بروموفنل بلو يا گزيلن سيانول ميباشد . رنگ برومو فنل بلودر ژل 1.5 درصد همراه با 500bp و درژل 0.8 درصد با 1000bpحركت ميكند )
جدول شماره 3 : مقايسه حركت رنگ نشانه و ماركر DNA روي ژل آگارز
درصد ژل آگارز | حركت تقريبي رنگ نشانه در مقايسه با ماركر | حركت تقريبي DNA در مقايسه با ماركر | |
برومو فنل بلو | Xylen cyanol | ||
0.4 | 500bp | 3 kbp | 2.5 kbp |
0.8 | 500 bp | 3 kbp | 1kbp |
1 | 500bp | 3 kbp | 500 bp |
1.25 | 500 bp | 3 kbp | 250bp |
1.5 | 100bp | 1kbp | 250bp |
2 | 100bp | 1kbp | 100bp |
درصد ژل پلي آكريلاميد | حركت تقريبي رنگ نشانه در مقايسه با ماركر | حركت تقريبي DNA در مقايسه با ماركر | |
برومو فنل بلو | Xylen cyanol | ||
3.5 | 100bp | 500 bp | 100 bp |
5 | 75bp | 250bp | 75bp |
8 | 50bp | 250bp | 50 bp |
12 | 25bp | 75bp | 25bp |
15 | 10bp | 60bp | 25bp |
20 | 10bp | 60bp | 5bp |
9- DNA داراي شارژ منفي است و براي الكتروفورز شدن بايد نمونه بطرف قطب منفي با شد تا هنگام الكترو فورز به سمت قطب مثبت حركت كند
10- تانك الكتروفورز را به منبع تغذيه وصل كنيد
11- پيچ Current را روي ماكزيمم قرار داده و ولتاژ را تنظيم كنيد (10V/centimetr )
وقتي رنگ نشانه سه چهارم طول ژل را طي كرد ژل را از تانك خارج كرده بانورUV نتيجه را مشاهده كنيد .
13- تهيه ژل پلي آكريلاميد :
قدرت تفكيك سازي اين ژل بسيار بالا است و قطعات DNA با طول كم نيز در اين ژل قابل رويت ميباشند و بسته به در صد ژل حتي اختلاف يك باز را ميتوان در قطعات DNA الكتروفورز شده مشاهده نمود .
1. شيشه ها، شانه ( Comb ) و فضاسازها ( Spacer) را با آب و دترژان خوب بشوييد و سپس با الكل 70 در صد آنهارا تميز كنيد تا چربي دستها روي آنها باقي نماند ( بجاي پنبه از گاز استفاده كنيد زيرا پرزهاي پنبه روي شيشه باقي ميمانند ) .
2. قالب ژل را آماده كرده و جهت جلوگيري از نشت ژل ازداخل آن اطراف آن را با آگارز 1در صد به دقت درز گيري (Seal) نماييد .
3. حجم قالب (cast ) را ( حجم ژل) با اندازه گيري طول وعرض قالب مشخص نماييد ( قطر ژل بسته به قطر فضا سازها يك و يا نيم ميليمتر است )
4. بسته به در صدژل مورد نظر مقدار آكريلاميد و بيس آكريلاميد لازم را (بصورت مخلوط 29 در صد آكريلاميد و 1درصد بيس آكريلاميد تهيه و در يحچال نگهداري ميشود) داخل لوله تميز بريزيد
5. از بافر 10xTBE با غلظت نهايي 1x اضافه كنيد وبا آب مقطر به حجم مورد نظر برسانيد
6. مقدار 100 ميكرو ليتر آمونيوم پرسولفات 10درصد و 3 ميكرو ليتر محلول TEMED به آن اضافه كنيد ( توجه داشته باشيد كه مونومرهاي اكريلاميد وبيس آكريلاميد در حال پليمريزه شدن هستند)
7. به آرامي محلول را در قالب از قبل آماده شده بريزيد و مراقب باشيد كه حباب هوا وارد آن نشود زيرا حباب هوا مانع انجام الكترو فورز ميشود .
8. به آرامي شانه را داخل قالب قرار دهيد تا بعد از پليمريزه شده ژل ، درون آن چاهك هايي جهت نمونه گذاري ايجاد شود
9. بعد از پليمريزه شده به آرامي شانه را درآورده و چاهك هارا با آب بشوييد تا اگر مونومرهاي پليمريزه نشده هنوزوجود دارد شسته شوند
10. گيره پاييني را باز كنيد وفضاساز پاييني را از قالب خارج كنيد
11. گيره هاي طرفين را باز كرده و دستگاه را طوري داخل تانك مخصوص قرار دهيدكه قسمت بريده شده شيشه رويي ( Notch ) به سمت محفظه بالايي ( تانك فوقاني) قرار گيرد
12. شيشه هاي دستگاه ( قالب) را با نصب گيره ها ي مخصوص به طرفين تانك , ثابت نماييد
13. محفظه هاي بالا و پايين تانك را با 1xTBE buffer پرنماييد بطوريكه بافر روي چاهك ها را بپوشاند. چنانچه بين دوشيشه قالب ( محل خارج كردن فضاساز پاييني ) كه در محفظه پاييني تانك قرار دارد حباب هوا مشاهده ميشود با يك سرنگ پر از بافر كه دار اي سر سوزن كج است حباب هوا را بيرون كنيد تا مانع جريان الكتريكي نشود و الكترو فورز بخوبي انجام گيرد
14. محصول PCR را ( همانند الكتروفورز با ژل آگارز) با بافر نمونه گذاري مخلوط كرده و توسط سرنگ هاميلتون نمونه گذاري را روي ژل انجام دهيد
15. محفظه بالايي تانك را به قطب منفي ومحفظه پاييني را به قطب مثبت منبع تغذيه وصل كرده و الكتروفورز كنيد
16. بعد ازخاتمه الكتروفورز ( وقتي رنگ نشانه به پايين ژل رسيد) جريان برق را قطع كرده و شيشه را از تانك جدا كنيد. با يك تيغه فلزي نازك به آرامي بين دو شيشه فشار آوريد تا دو شيشه از هم جداشوند . ژل به يكي از دو شيشه مي چسبد . به آرامي آنرا داخل آب حاوي 10 ميكروگرم درهرميلي ليتر اتيديوم برومايد قرار دهيد تا بعد از چند دقيقه ژل رنگ شود .
ژل را روي دستگاه UV Transilluminator قرار داده و نوارهاي هاي DNA را مشاهده كنيد.
14-P.C.I extraction
هدف از اين كار حذف پروتئنهاي موجود در محلول حاوي DNA ميباشد . فنل ( equilibrated phenol با pH بيشتر از 7.5) موجب دناتوده شدن پروتئنها ميشود و كلرفرم نيز بقاياي فنل را از محلول واكنش حذف ميكند .
1- هم حجم محلول حاوي DNA فنل اضافه كنيد و مدت 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد ( فنل متعادل شده به علت 8-hydroxyquinoline ماده آنتي اكسيدان ) زرد رنگ است و روي آن با يك لايه بافر تريس پوشانيده شده است هنگام استفاده از فنل زير بافر استفاده كنيد)
2- مايع رويي ( مايع شفاف ) را به لوله تميز ديگري انتقال دهيد ( فنل در زير قرار ميگيرد و پروتئنهاي دناتوره شده بين دو لايه قرار ميگيرند).
3- هم حجم آن از مخلوط كلرفرم - ايزو آميل الكل ( 1:24) اضافه كنيد( ايزو آميل الكل يك ماده Anti foam است و مانع كف كردن محلول ميشود ) و مانند مرحله قبل ادامه دهيد
4- مايع رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد ويا مانند روش زير ميتوان عمل نمود:
5- مخلوط فنل - كلرفروم - ايزو آميل الكل (به نسبت 1:24:25) تهيه كنيد
6- حجم مساوي از مخلوط P.C.I به محلول حاوي DNA اضافه كنيد و 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد
7- محلول رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد و هم حجم آن C.I اضافه كنيد و 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد
8- محلول رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد (محلول حاوي DNA است )
9- اگر هنوز بوي فنل از آن متصاعد ميشود مرحله 7 را تكرار كنيد.
10- DNA را با الكل رسوب دهيد( تغليظ DNA ).
15- رسوب DNA با الكل ( تغليظ DNA )
هدف از اين كار احياي DNA بعد از استخراج و يا بعد از P.C.I. extraction ميباشد و در مواقعي نيز كه DNA خيلي رقيق باشد بدينوسيله آن را تغليظ ميكنيم.
1- حجم محلول حاوي DNA را تعيين كنيد ( تخمين بزنيد )
2- استات سديم با غلظت نهايي 0.3M به آن اضافه كنيد .
3.- مقدار دوبرابر حجم آن الكل مطلق سرد ( 20- يا 70-) اضافه كنيد
4- مدت 10 دقيقه با 12000xg سانتريفيوژ كنيد . رسوب سفيد رنگ را ميتوان در ته لوله مشاهده نمود ( لازم به ذكر است كه DNA خالص تقريبا" بيرنگ است ).
5- . با وارونه كردن لوله , مايع رويي را حذف كنيد و لوله را بصورت وارونه روي كاغذ جاذب الرطوبه قرار دهيد تا آب آن حذف شود .
6- مقدار 100 ميكرو ليتر الكل 70 درجه به آن اضافه كنيد و آن را ورتكس كنيد تا رسوب DNA از ته لوله كنده شده و شناور گردد ( اگر DNA بزرگ با شد ورتكس موجب شكسته شدن آن ميشود) .
7- مدت 5 دقيقه آن را سانتريفيوژ كنيد ( شستن DNA)
الكل را خالي كرده و DNA را در 70 درجه خشك كنيد ( چنانچه در اين مرحله DNA خوب خشك نشود والكل همراه آب داخل آن بماند بعدا" براي كار كردن با آنزيمها دچار اشكال ميشويد). DNA را در مقدار بافر ( آب ) دلخواه حل كنيد .
16- احياي DNA از ژل آگارز
هدف از اين قسمت كسب مهارت براي احياي DNA از روي ژل آگارز ميباشد. اين تكنيك در بيولوژي مولكولي و مهندسي ژنتيك اهميت زيادي دارد و در كلونينگ و انتقال ژن استفاده ميشود لازم به ذكر است كه از طرق مختلف اين كار انجام ميشود مانندFreez- Squeez, paper elution, Electero elution , و... ولي فقط دو روش توضيح داده ميشود :
الف ) احياي DNA ازروي ژل توسط كاغذ ( paper elution )
1- DNA مورد نظر رابا ژل آگارز 1-2درصد الكتروفورز كنيد و اجازه دهيد تانوارهاي هاي DNA بخوبي از همديگر تفكيك شوند
2- با نور UV ( طول موج 254 نانومتر موجب آسب DNA ميشود و بهتر است از طول موج 312 نانومتر استفاده گردد ) نوارهاي مورد نظر را مشاهده كرده و جلو آن را با تيغ اسكالپر تميز علامت گذاري كنيد
3- در جلو band يك حفره ايجاد كنيد ( عرض حفره مساوي عرض band باشد )
4- يك قطعه كاغذ واتمن و يك قطعه كيسه دياليز ( dialysis tubing ) به اندازه حفره ببريد
5.- كاغذ واتمن را در جلو حفره و كيسه دياليز را در پشت كاغذ قرار دهيد
6- الكترو فورز را ادامه دهيد ( بافر تانك را كمتر كنيد بطوري كه روي ژل را نپوشاند )
7- وقتي DNA وارد كاغذ شد الكترو فورز را متوقف كنيد
8.- كاغذ را جمع كرده و به لوله 5/ ميلي ليتري كه انتهاي آن سواخ شده است انتقال دهيد
9. توسط سمپلر مقدار مناسب با فر
(150mM NaCl , 20mM Tris (pH=7.5) 1mM EDTA , 5%SDS) روي كاغذ بريزيد
10- لوله مذكور را داخل يك لوله بزرگتر قرار دهيد ( 5/1 ميلي ليتر ) ، سانتريفيوژ كنيد تا مايع از ته لوله كوچك به داخل لوله بزرگتر حركت كند ، چند دفعه اينكار را تكرار كرده تا موقعي كه ديگر DNA روي كاغذ واتمن مشاهده نشود ( با نور UV آزمايش شود )
11- اين بافر را جمع آوري كرده و با P.C.I استخراج كرده و با الكل تغليظ كنيد
ب) احياي DNA از روي ژل آگارزLow Melting Point (LMP)
1- DNA مورد نظر را با آگارز LMP 2درصد الكترو فورز كنيد و اجازه دهيد تا نوارهاي DNA خوب تفكيك شوند
2- با نور UV ( طول موج 254 نانومتر موجب اسيب DNA ميشود و بهتر است از طول موج 312 نانومتر استفاده گردد ) band مورد نظر را مشاهده كنيد
3- band مورد نظر را با تيغ اسكالپر تميز علامت گذاري كنيد
4- ژل را روي كاغذ سفيد قرار داده و band مورد نظر را بريده به لوله تميرديگر منتقل كنيد
5- قطعه ژل را يك شب در فريزر 20- درجه قرار دهيد
6- قطعه ژل را در حرارت اتاق قرار دهيد و سپس 5 دقيقه در آب 65 درجه انكوبه كنيد
7-آن را به حرارت اتاق منتقل كرده و دو مرتبه با P.C.I استخراج كنيد تا ژل از آن حذف شود
8.- استات سديم ( غلظت نهايي 0.3M ) اضافه كرده با الكل رسوب دهيد
كلونينگ ( Cloning )
17- اتصال دو DNA به يكديگر در آزمايشگاه :
براي اتصال دو DNA به يكديگر در آزمايشگاه از آنزيم DNA ligase استفاده ميشود DNA ligase آنزيمي است كه بين دو نوكلئوتيد اتصال فسفودي استر ايجاد ميكند. دو نوع DNA ligase وجود دارد يكي T4 DNA ligase كه از فاژ T4 استخراج ميشود وانرژي لازم براي فعاليت خود را از ATP تامين ميكند اين آنزيم دوانتهاي blunt وهمچنين دوانتهاي Cohesive را بهم متصل كند( اتصال فسفودي استر ايجاد ميكند). ديگري DNA ligase باكتري E.coli كه انرژي لازم براي فعاليت خودراازNAD بدست مي آورد و بيشتر براي اتصال انتهاهاي Cohesive استفاده ميشود.
عمل Ligation طي سه مرحله انجام ميگيرد :
در مرحله اول گروه آدنيليل از ATP ) NAD ) به آنزيم متصل ميشود و زنجيره جانبي NH2 اسيد آمينه ليزين آدنيله ميشودو پيرو فسفات (با آنزيم T4 DNA ligase ) يا نيكو تيناميد (با آنزيم E.coli DNA ligase ) آزاد ميشود.در مرحله دوم گروه آدنيليل به انتهاي 5`-P متصل ميشود . در مرحله سوم اتصال فسفو دي استر بين گروه هيدروكسيل 3`- OH و گروه فسفوريل آدنيله شده 5` برقرار ميشودوAMP آزاد ميگردد.
منبع: http://www.iranbiotech.com
/س
