كارگاه عملي – نظري كلونينگ , نشاندار كردن و هيبريديزاسيون اسيد هاي نوكلئيك(قسمت آخر)
نويسنده:دكتر بهرام كاظمي
سيستم هاي آنزيمي R-M نوع II:
نامگذاري آنزيمهاي R-M
2- بعد از سه حرف مذكور حرف اول سويه يا گونه بصورت غير ايتاليك و يا اعداد عربي مي آيد مانند: EcoK بري Ecoli سويه K ، Hind براي H.influenza سويه d يا Sau 3A براي استافيلوكوك اورئوس 3A . عناصر خارج كروموزومي مانند ويروس يا پلاسميد به همين صورت متعاقب اسم مذكور آورده ميشود مانند: EcoRI و EcoPI.
3- متعاقب آن بدون در نظر گرفتن فاصله ، اعداد روماني (I,II,III,.....) براي تعيين آنزيم هاي مختلف كه توسط همان سويه توليد ميشوند مانند HindII و HindIII .
4- براي اختصاصي كردن R.ENase يا M.MTase حروف بزرگ R و M در جلو نشانه آنزيم قرار ميگيرد و با يك نقطه از آن فاصله ميگيرد مانند : R.EcoRI و M.EcoRI.
جدول شماره 6- كد اسيد هاي نوكلئيك جايگاه شناسايي آنزيم ها ي محدود گر
اسيد نوكلئيك | كد | اسيد نوكلئيك | كد |
A, C or T | H | G or A | R |
A, C or G | V | C orT | Y |
C, G or T | B | A or T | W |
A, G or T | D | A or C | M |
G, A, T or C | N | G or T | K |
|
| C or G | S |
Third position (3` end) | Second position | First position (5` end) | |||
G | A | C | U | ||
U | Cys | Tyr | Ser | Phe |
U |
U | Arg | His | Pro | Leu |
C |
U | Ser | Asn | Thr | Ilu |
A |
U | Gly | Asp | Ala | Val |
G |
GUG - بندرت به عنوان رمز شروع كننده قرار ميگيرد.
جدول شماره 8- حروف رمز اسيد هاي آمينه
نام اسيد آمينه | رمز يك حرفي | رمز سه حرفي | نام اسيد آمينه | رمز يك خرفي | رمز سه حرفي |
آلانين | A | Ala | لوسين | L | Leu |
آرژنين | R | Arg | ليزين | K | Lys |
آسپاراژين | N | Asn | متيونين | M | Met |
آسپارتيك | D | Asp | فنيل آلانين | F | Phe |
سيتئين | C | Cys | پرولين | P | Pro |
گلوتامات | E | Glu | سرين | S | Ser |
گلوتامين | Q | Gln | تره اونين | T | Thr |
گليسين | G | Gly | تريپتوفان | W | Trp |
هيستيدين | H | His | تيروزين | Y | Tyr |
ايزولوسين | I | Ile | والين | V | Val |
atI AGG!CCT
AatII GACGT!C
AccI GT!MKAC
AccII CG!CG
AccIII T!CCGGA
AcyI GR!CGYC
AflI G!GWCC
AflII C!TTAAG
AflIII A!CRYGT
AhaI CC!SGG
AhaII GR!CGYC
AhaIII TTT!AAA
AluI AG!CT
AlwI GGATCNNNN!
AlwI !NNNNNGATCC
AlwNI CAGNNN!CTG
AocI CC!TNAGG
AocII GDGCH!C
AosI TGC!GCA
AosII GR!CGYC
ApaI GGGCC!C
ApaLI G!TGCAC
ApyI CC!WGG
AquI C!YCGRG
AseI AT!TAAT
Asp700I GAANN!NNTTC
Asp718I G!GTACC
AspI GACN!NNGTC
AsuI G!GNCC
AsuII TT!CGAA
AvaI C!YCGRG
AvaII G!GWCC
AvaIII ATGCA!T
AvrI CYCGRG
AvrII C!CTAGG
AxyI CC!TNAGG
BalI TGG!CCA
BamHI G!GATCC
BanI G!GYRCC
BanII GRGCY!C
BanIII AT!CGAT
BbeI GGCGC!C
BbiII/AcyI GR!CGYC
BbvI GCAGCNNNNNNNN!
BbvI !NNNNNNNNNNNNGCTGC
BbvII GAAGACNN!
BbvII !NNNNNNGTCTTC
BcefI ACGGCNNNNNNNNNNNN!
BcefI !NNNNNNNNNNNNNGCCGT
BclI T!GATCA
BcnI CC!SGG
BglI GCCNNNN!NGGC
BglII A!GATCT
BinI !NNNNNGATCC
BinI GGATCNNNN
BsmAI GTCTC
BsmAI GAGAC
BsmI GAATGCN!
BsmI G!CATTC
Bsp1286I GDGCH!C
BspHI T!CATGA
BspMI ACCTGCNNNN!
BspMI !NNNNNNNNGCAGGT
BspMII T!CCGGA
BsrI ACTGGN!
BsrI C!CAGT
BstBI TT!CGAA
BstEII G!GTNACC
BstI G!GATCC
BstNI CC!WGG
BstPI G!GTNACC
BstUI CG!CG
BstXI CCANNNNN!NTGG
BstYI R!GATCY
Bsu36I CC!TNAGG
CcrI C!TCGAG
CfoI GCG!C
Cfr10I R!CCGGY
Cfr13I G!GNCC
CfrI Y!GGCCR
ClaI AT!CGAT
CviJI RG!CY
CvnI CC!TNAGG
DdeI C!TNAG
DpnI GA!TC
DraI TTT!AAA
DraII RG!GNCCY
DraIII CACNNN!GTG
DsaI C!CRYGG
EaeI Y!GGCCR
EagI C!GGCCG
EarI CTCTTC
EarI GAAGAG
EclXI C!GGCCG
Eco105I TAC!GTA
Eco31I GGTCTCN
Eco31I !NNNNNGAGACC
Eco47I G!GWCC
Eco47III AGC!GCT
Eco52I C!GGCCG
Eco57I CTGAAG
Eco57I CTTCAG
Eco81I CC!TNAGG
EcoNI CCTNN!NNNAGG
EcoO109I RG!GNCCY
EcoRI G!AATTC
EcoRII !CCWGG
EcoRV GAT!ATC
EcoT14I C!CWWGG
EcoT22I ATGCA!T
EcoT38I GRGCY!C
EheI GGC!GCC
EspI GC!TNAGC
FinI GTCCC
FinI GGGAC
Fnu4HI GC!NGC
FokI GGATGNNNNNNNNN!
FokI !NNNNNNNNNNNNNCATCC
FspI TGC!GCA
GdiII !NNNNNYGGCCG
GdiII CGGCCRN!
GsuI CTCCAG
GsuI CTGGAG
HaeI WGG!CCW
HaeII RGCGC!Y
HaeIII GG!CC
HapII C!CGG
HgaI GACGCNNNNN!
HgaI !NNNNNNNNNNGCGTC
HgiAI GWGCW!C
HgiEII ACCNNNNNNGGT
HhaI GCG!C
Hin1I GR!CGYC
HinP1I G!CGC
HincII GTY!RAC
HindIII A!AGCTT
HinfI G!ANTC
HpaI GTT!AAC
HpaII C!CGG
HphI GGTGANNNNNNNN!
HphI !NNNNNNNTCACC
KpnI GGTAC!C
Ksp632I CTCTTCN!
Ksp632I !NNNNGAAGAG
MaeI C!TAG
MaeII A!CGT
MaeIII !GTNAC
MboI !GATC
MboII GAAGANNNNNNNN!
MboII !NNNNNNNTCTTC
MfeI CAATTG
MflI R!GATCY
MluI A!CGCGT
MmeI TCCRAC
MmeI GTYGGA
MnlI CCTCNNNNNNN!
MnlI !NNNNNNNGAGG
MroI T!CCGGA
MseI T!TAA
MspI C!CGG
MstI TGC!GCA
MstII CC!TNAGG
MvaI CC!WGG
NaeI GCC!GGC
NarI GG!CGCC
NciI CC!SGG
NcoI C!CATGG
NdeI CA!TATG
NdeII !GATC
NheI G!CTAGC
NlaIII CATG!
NlaIV GGN!NCC
NotI GC!GGCCGC
NruI TCG!CGA
NsiI ATGCA!T
Nsp(7524)I RCATG!Y
Nsp(7524)V TT!CGAA
NspBII CMG!CKG
NspII GDGCH!C
NspIII C!YCGRG
NspIV G!GNCC
NunII GG!CGCC
PaeR71 C!TCGAG
PalI GG!CC
PflMI CCANNNN!NTGG
PleI GAGTCNNNN!
PleI !NNNNNGACTC
PmaCI CAC!GTG
PpuMI RG!GWCCY
PstI CTGCA!G
PvuI CGAT!CG
PvuII CAG!CTG
RsaI GT!AC
RsrI G!AATTC
RsrII CG!GWCCG
SacI GAGCT!C
SacII CCGC!GG
SalI G!TCGAC
Sau3AI !GATC
Sau96I G!GNCC
SauI CC!TNAGG
ScaI AGT!ACT
ScrFI CC!NGG
SduI GDGCH!C
SecI C!CNNGG
SexI CTCGAG
SfaNI GCATCNNNNN!
SfaNI !NNNNNNNNNGATGC
SfiI GGCCNNNN!NGGCC
SinI G!GWCC
SmaI CCC!GGG
SnaBI TAC!GTA
SnaI GTATAC
SpeI A!CTAGT
SphI GCATG!C
SplI C!GTACG
SspI AAT!ATT
SstI GAGCT!C
SstII CCGC!GG
SstIII ACGT
StuI AGG!CCT
StyI C!CWWGG
StySJI GAGNNNNNNGTRC
StySJI GYACNNNNNNCTC
TaqI T!CGA
TaqII GACCGANNNNNNNNNNN!
TaqII !NNNNNNNNNTCGGTC
TaqII CACCCANNNNNNNNNNN!
TaqII !NNNNNNNNNTGGGTG
ThaI CG!CG
Tsp45I GTSAC
TspEI AATT
Tth111I GACN!NNGTC
Tth111II CAARCANNNNNNNNNNN!
Tth111II !NNNNNNNNNTGYTTG
TthHB8I T!CGA
VspI AT!TAAT
XbaI T!CTAGA
XcyI C!CCGGG
XhoI C!TCGAG
XhoII R!GATCY
XmaI C!CCGGG
XmaIII C!GGCCG
XmnI GAANN!NNTTC
XorII CGAT!CG
26- نشان دار كردن اسيد هاي نوكلئيك
مقدمه: نشاندار كردن اسيد هاي نوكلئيك تحول بزرگي در بيولوژي مولكولي ايجاد نمود. اين تكنيك براي تاييد كارهاي مولكولي و همچنين غربالگري كلني هاي باكتري حاوي پلاسميد نوتركيب ( هيبريداسيون ) استفاده مشود. انشاا…. در اين كارگاه با روشهاي نشاندار كردن اسيد هاي نوكلئيك بصورت عملي آشنا خواهيم شد و روش هيبريديزاسيون را عملا" انجام ميدهيم. دراينجا مختصري از كارهايي كه انجام خواهد شد توضيح داده ميشود.
رو شهاي نشاندار كردن آنزيماتيك DNA :
Nick Translation
سنتز پروب بكمك .PCR
در nick translation نوكلئوئيدهاي نشاندار نشده با نوكلئوئيدهاي نشاندار شده تعويض ميشوند) سنتزجابجايي.( در دو رو ش ديگر منجربه سنتز DNA جديد مي شود (Net synthesis)
27- Random - primed labeling
در هيبريديزاسيون علاوه بر استفاده از پروب هاي نشاندار شده با راديوايزوتوپها ازگروههاي تغيير يافته غير راديواكتييو مانند بيوتين ياديگوكسي ژنين نيز استفاده ميشود .اين رو ش در سال 1984 و 1983توسط Feinberg و Vogelstein ابداع گرديد .نشانداركردن توسط آنزيم klenow انجام ميشود كه قطعه بزرگ DNA پلميراز I اشرشياكلي ميباشد. Klenow فاقد فعاليت اگزونوكلئازي 5` 3` ميباشد ولي برعكس داراي فعاليت اگزونوكلئازي 3` 5` ميباشد. براي نشاندار كردن با روش Random - Priming اول DNA دو رشته‌اي )خطي( توسط حرارت دناتوره شده و سپس روي يخ سرد ميشود تامانع رناتوراسيون DNA شده ويصورت زنجيره ها ي تك رشته اي باقي بماند. Supercoiled DNA مقدار كمتري نشاندار ميشود چون Reannealing رشته هاسريعتر انجام ميشود.بنا براين مولكولهاي DNA حلقوي بايد قبل از نشاندار شدن بصورت خطي درآمده باشند تا عمل Labeling به مقدار زياد انجام گيرد.از قطعات كوچك DNA هگزا نوكلئوتيدي با تواليهاي‌متفاوت به عنوان پرايمر(آغازگر (براي سنتز DNAبكمك يك آنزيم DNA پليمراز استفاده‌ميشود .مخلوط هگزانوكلئوتيدهابه روش تصادفي – اتفاقي به DNA دناتوره شده هدف Anneal ميشوند. اين اليگونوكلئوتيدهادر واكنش پليمرازبعدي به عنوانprimer عمل ميكنند. سنتز پروب با اضافه كردن آنزيم پليمراز klenow و چهاردزوكسي نوكلئوتيد تري فسفات(كه حداقل يكي ازآنها (dUTP) باهاپتن نشاندارشده است) شروع ميشود .چون پرايمرها خاصيت تصادفي - اتفاقي دارند ميتوانند به همه ترادف هاي هدف ا تصال يابند . در اثناي سنتزبه روش Random - primed هر دو زنجيره DNA )رشته‌هاي مكمل DNA هدف (بعد از دناتوراسيون به عنوان الگو عمل ميكنند .غلظت زيا'د پرايمر مانع Reanealing دورشته الگو با يكديگر ميشود.در اين روش به علت عمل پرايمرهاي كوتاه معمولا" رشته DNA نشاندار كوتاهتر از DNA الگو مي باشد .چون هر دو رشته DNA اصلي به عنوان Template عمل ميكنند رشته هاي پروب نشاندار نيز تا اندازه‌اي مكمل يكديگر هستند، بطوري كه قبل از هيبريديزاسيون لازم است دناتوره شوند.از روش Random - primedبراي نشاندار كردن قطعات DNA به مقدار چند نانوگرم تا چندين ميكروگرم استفاده ميشود .نشاندار شدن بعداز 30ـ60 دقيقه به حداكثر ميرسد و هنگام انكوباسيون طولاني ورود ماده نشاندا ر به رشته ثابت است . حساسيت ها’پتن‌هايي مانند بيوتين و Digoxigeninاز طريق Random priming تا 100فمتوگرم DNA مبباشد.
28- Nick translation
اين روش اولين با ربراي نشاندار كردن پروب با را ديوايزوتوپ توسط Rigny در سال 1977 ابداع گرديد. در اين روش عمل دو آنزيم DNase I و DNA polymerase I اشرشياكلي روي DNAدو رشته‌اي همزمان‌انجام ميگيرد. DNase I يك اندونوكلئاز اختصاصي هيدروليز كننده باند هاي فسفودي استر رشته هاي DNA ميباشد. اين عمل منجربه ايجاد اليگونوكلئوتيدهاي كوتاه حاوي 5` فسفات ميشود. عمل آنزيم روي هر رشته DNA مستقيما و در حضور يون Mg2+انجام ميگيرد و شكافهايي در DNAيك رشته‌اي بوچود مي آورد كه تعداد آنها به غلظت Dnase Iدر مخلوط انكوباسيو ن بستگي دارد.اين عمل با غلظت پايين Dnase I هم انجام ميشود . در اين شرايط فقط-تعداد كمي Nick در هر زنجير DNA به وجود ميآيد .آنزيم DNA Polymerase I داراي سه فعا'ليت كاتا'ليتيك مستقل يعني پليمرازي 5` 3®` , اگزونوكلئازي 5`3® ` واگزونوكلئازي 3`® 5` ميباشد..فعاليت نوكلئاز ي 5` 3®` آنزيم باعث حذف دزوكسي نوكلئوتيدها از انتهاي 5` فسفات ميشود، با فعاليت پليمرازي 5` 3® ` آن ، آنزيم مذكوربطور همزمان نوكلئوتيدتري فسفاتها را به انتهاي 3`-OH آ زاد شكاف (Nick) ا'ضافه ميكند .اگر دزكسي نوكلئوتيد تري فسفات هاي همراه دزوكسي نوكلئوتيدتري فسفاتهاي‌تغيير يافته با ها'پتن در مخلوط واكنش با شند در اثناي واكنش پليمريزاسيون هاپتن وارد زنجيره ميشود .چون عمل DNA Polymerase I وابسته به DNA الگو است ترادف نوكلئوتيدي هنگام Nick translation بدون تغييربا قي ميماند.
29- نشاندار كردن DNA توسطPCR
PCRيك روش توانمند براي سنتز پروبهاي DNA ( DNA بدون وكتور (مي'باشد اين روش در سال1984توسط موليس ابداع گرديد وبراي كارهايي مانند تكثير, , Cloning Sequencingو سنتز پروب بكار گرفته شد .در اين روش دو پرايمرحاوي دزوكسي نوكلئوتيدتري فسفاتهاي نشاندار شده درپليمريزاسيون DNA شركت ميكنند PCR .توسط يك DNA پليمراز گرمادوست-مانند Taq انجام ميشود .واكنش Amplification در30 سيكل حرارتي در سه مرحله دناتوراسيون، Annealingو Extenssion انجام ميگيرد.
30- هيبريديزاسيونHybridization
DNAدو رشته‌اي محلول تحت تاثير حرار ت دناتوره ميشود .اگر حرار ت در حدTm مولكول DNA باشد دناتوراسيون برگشت ناپذير است يعني رشته‌هايDNA در محيط سرما جدا از يكديگر باقي ميمانند Tm .يك مولكول DNA دو رشته‌اي ايستايي DNA در حرارت مي'باشد .(Function of the Thermal Stability) در يك DNA هومولوگ اين پديده انعكاس نسبت با زها يعني محتواي G+C موجود در DNA ميباشد. Cو Gبا سه اتصال هيدروژني بهم متصل ميشوند در حاليكه Tو A با دو اتصال بهم مربوط ميشوند Tm .مولكولDNA تحت تاثير قدرت يوني محيط (با افزايش يونهاTm بالا ميرود(، حضور يونها(Mg+) ، پلي ساكاريدها, پرتئين و حلالهاي آلي (Formamide) قرار ميگيرد .رشته‌هاي DNA دو رشته‌اي دناتوره شده در حرار ت كمتر از Tm خودبخودبهم چسبيده و نهايتابا DNA مكمل خود يك هيبريد پايدارتشكيل ميدهند بنا بر اين واكنش از كينتيك ثانوي (Second- Order Kinetics) تبعيت ميكند. هيبريديزاسيون نيز شبيه Tm تحت تاثير فاكتورهايي مانند قدرت يوني و حلالهاي آلي قرار ميگيرد. اصطلاح Stringency در اين مورد مفهوم مهمي است اما همه اين فا'كتورها )حرارت ، غلظت نمك، وجود حلالهاي آلي( را دربرنميگيرد .در شرايط Stringency پايين )نمك زياد و حرارت كمDNA ( هاي با شباهت كمتر با همديگر هيبريد ميشوند .در صورتيكه درStringency بالا) غلظت كم نمك و حرارت بالا در حضور فرماميد( Hybridization فقط بين دو DNA باهومولوژي با لا اتفاق ميافتد .در اين شرايط حرارت Hybridization30ـ20 درجه پايين تر از (melting temprature) tm است .براي انجام Hybridizationبايد DNA هدف را روي يك پشتيان جامد منتقل نمود تا DNA نشاندار (بصورت محلول) با DNA هدف هيبريد تشكيل دهند .در ساترن بلات DNA يا RNA روي ژل آگارز الكتروفورز ميشوند و سپس روي غشاي نيتروسلولزيا نايلوني منتقل ميگردند .از مواد پشتيان كننده ديگر مانند سلولز فعال، سفاكريل، پلي استيرن يا بيدهاي مگنيتك نيز ميتوان استفاده نمود.
پارامترهايHybridization
پايداري هيبريد:
تشكيل هيبريدهاي اسيدنوكلئيك يك پروسه برگشت پذير است . Tm عبارت است از حرارتي كه نصف مولكولهاي DNA دوپلكس‌به تك رشته تبديل ميشوند و تحت تاثيرغلظت نمك كاتيونهاي يك ظرفيتي) مول بر ليتر (تعداد نوكلئوتيدهاي زنجيره، تركيب'بازها ( كه با G+C بيان ميشود (و غلظت عوامل ناپايدار كننده هليكس مانند Formamideقرار ميگيرد.
كينتيك هيبريديزاسيون پروبهاي تك رشته‌اي: (Riboprobe)
ميزان تشكيل هيبريد براي پروبهاي تك رشته‌اي از كينتيك اوليه (First - Order Kinetics)تبعيت ميكند زيرا تقريبا هميشه غلظت پروب بيشتر از Target DNAاست ، بالاترين ميزان هيبريديزاسيون در محلول بصورت تجربي مشخص ميشود. درجه Tm در دو پلكس DNA- DNA 15 درجه كمتر از دوپلكسRNA-DNA است. غلظت كاتيون (M) تاثير كمتري روي ميزان (Constant rate) ثابت هيبريديزاسيون DNA-DNAدارد .ميزان هيبريديزاسيون تحت ثير قدر ت يوني پايين قرار ميگيرد. هيبريديزاسيون در 1M NaCl هفت برابربيشتر از 0.18M NaCl انجام ميگيرد .كاهش غلظت نمك در حد 0.09M NaCl تا 5 برابر ميزان هيبريديزاسيون را كاهش ميدهد. تا ثير نمك روي تشكيل دوپلكس RNA- DNA تا اندازه‌اي با آنچه ذكر شد اختلاف دارد .در 0.1M NaC تشكيل DNA-RNA همسنگ DNA-DNA (Equivalent) است ولي در 1M NaCl ميزان تشكيل دوبلكس RNA-DNA دوبرابر 0.18M است.
كينيك هيبريديزاسيون در پروبهاي دو رشته‌اي (DNA)
در پروبهاي دو رشته‌اي هيبريديزاسيون از كينتيك ثانويه (Second - Order Kinetics)تبعيت ميكند. اين پروبهامي توانند بااسيدهاي نوكلئيك ثابت شده روي فيلتر هيبريد شوند و يادر محلول دوباره Renature گردند. در نتيجه هيبريديزاسيون 5 برابر آهسته تر از پروبهاي تك رشته‌اي انجام ميگيرد. پليمرهاي دكستران آنيوني) دكستران سولفات 500) ياپلي اتيلن گليكول 6000 اتصال دو رشته پرو ب را در محلول به همديگرتشديد ميكنند .دكستران سولفات محلول را از DNA خارج ميكند بنا براين غلظت موثر DNA افزايش مييابد .اثر دكستران سولفات براي پلي نوكلئوئيدهاي بيشتر از250bp مشهودتر است و روي اليگونوكلئوئيدها تاثيري ندارد. وقتي از پروبهاي تك رشته اي استفاده ميشودهيبريديزاسيون تا سه برابر افزايش ميابدو وقتي از Nick translated probe استفاده شود تا 100برابر ميشود .مولكول‌هايي كه از طريق Nick translation نشاندار شده‌اند دكستران سولفات تشكيل شبكه پروب (probe network)يا hyper polymer هاراتسريع نميكند وتاكيد ميشود كه تشكيل چنين شبكه‌هايي به اندازه پرو ب بستگي دارد. خاطر نشان ميسازد كه اگر دكستران سولفات در محيط نباشدbackground هاي غيراختصاصي زياد ميشوند.
روش كار:
براي نشاندار كردن قطعه DNA ( پروب) از كيتRandom Primed DNA Labeling شركت Roch Molecular Biochemicals كه با سيستم Digoxigenin (غير راديواكتيو) كار ميكند استفاده ميشود. ديگوكسي ژنين يك هاپتن استروئيدي است كهDNA ، RNAو اليگونوكلئوئيدها را جهتHybridization نشاندار ميكند. و ظهور(Detection) آن بصورت كالريمتري انجام ميشود. براي نشاندار كردنDNA ، ديگوكسي ژنين از طريق اتصال استري وارد dUTP ميشود، اتصال فوق دربرابر قليا (alkali) ناپايداربوده و اين يك امتيازي است كه DIG - 11 - dUTP به آساني توسط قليااز رشته مكمل روي Filter ( كاغذ نيتروسلولز يا غشا’ نايلون) شسته شده و ميتوان دوباره از فيلتربراي هيبريديزاسيون با پرو ب ديگر استفاده نمود.
ـ DNA را مد ت 10 دقيقه در آ بجو ش قرار داده دهيد تا به Single strand DNA تبديل شودوبلافاصله‌ان را روي يخ حاوي نمك منتقل كنيد و مواد زيررا به آن اضافه نماييد.
ـ 2 ميكروليتر ازمخلوط هگزانوكلئوئيدها
- 2 ميكروليتر مخلوط.dNTP
- آب مقطر تا حجم 19 ميكروليتر
- 1 ميكروليتر آنزيم klenow
با دست به ته لوله ضربه بزنيدتا مواد داخل لوله مخلوط شوندو مختصري سانتريفوژكنيد (quick spin)
- مد ت 24 ساعت (O/N) در 37 درجه قراردهيد.
- واكنش رابا EDTA متوقف كرده وبراي پرسيپيتاسيون Licl با غلظت نهائي 0.5 M به آن اضافه كنيد
-رسوب حاصل را در 50 ميكروليتر بافر TE حل كنيد.
ـ براي كنترل Labeling يك واكنش نيزبا DNA كنترل موجود در كيت انجام دهيد.
بررسي كمي و كيفي پروب نشاندار شده:
از پروب نشاندار شده رقت سريال( 10/1, 100/1, 1000/1) تهيه كنيد ( به هر يك از ويال‌ها 9 ميكروليتر آب اضافه كرده سپس يك ميكروليتر از پروب به لوله اول اضافه كرده و خوب مخلوط كنيد و همينطور يك ميكروليتر از لوله اول به لوله دوم منتقل كنيدو……..) با انجام Dot blotروي نايلون يا نيتروسلولز آنهارا ظاهر (detect) كنيد.
- پس از انجام (dot) لكه‌گذاري قبل از اينكه لكه‌ها'كاملا خشك شوند توسطUV Crosslinker ( مقدار 12000 ژول انرژي) آنها را روي غشا ثابت كنيد ( وقتي DNA در معرض UV قرار گيرد تيمين موجود در آن با گروههاي آمين روي سطح نايلون cross-link ميشوند .
- نايلون را مدت 10 دقيقه دربا فر I قرار دهيد. غشا را مدت 1 ساعت دربا فر II قرار دهيد تا فيلتر block شود( جاهائيكه DNA وجود ندارد توسط BSA پوشيده (block) ميشود تا آنتي بادي نتواند روي غشا بچسبد)
- غشا را مدت 20 دقيقه در Anti Dig بارقت 5000/1 قرار دهيد.
- غشا را چند دفعه با بافر I شستشو داده تا آنتي با دي‌هاي متصل نشده از روي فيلتر حذف شوند.
- غشا را بابافر III شستشو دهيد
- لكه‌هاي روي غشا را با (Nitro Blue Tetrazolium (NBT و (Bromo Chloro Indolyl Phosphate (BCIP ظاهر كنيد
ـ با مقايسه رنگ لكه‌ها بارنگ لكه DNA كنترل نشاندار شده موجود در كيت مقدار پروب نشاندار شده را محاسبه كنيد). هر ميكروگرم DNA كنترل حاوي ... نانوگرم DNA نشاندار شده ميباشد.
تهيه Riboprobe
ـ داراي طول معيني بوده و اختصاصي وتك رشته‌اي مي با شند.
شبيه DNA probe ها به يكديگر متصل نميشوند.
ـ اتصال Dig به UTP نسبت به NaOH مقاوم ميباشد.
رو ش كار:
ـ بعد از اتمام واكنش آن را P.C.I extroction كرده سپس با الكل رسوب دهيد.(هرگزازRNase استفاده نكنيد).
-2 ميكروليتر NTP به واكنش اضافه كنيد.
- 2 ميكروليتر 10X Transcription Buffer به آن‌ا ضافه كنيد.
ـ 1 ميكروليتر ((T3, T7) RNA ploymerase به آن اضافه كنيد.
- حجم واكنش را با آب مقطربه 20 ميكروليتر برسانيد.
-1 ميكروليتر RNasin ( مهار كننده RNase ) به واكنش اضافه كنيد تااز فعاليت RNase احتمالي درواكنش جلوگيري كند.
- لوله را مختصري سانتريفيوژ (quick spin) نموده و 2ـ1 ساعت در 37 درجه قرار دهيد.
- واكنش رابا EDTA متوقف نموده وبراي رسوب دادن RNA ازLiCl باغلظت نهائي 0.5M استفاده كنيد.
- بعد از شستشو با الكل 70، رسوب را در 100 ميكروليترDEPC treated water حل كنيد.
- مقدار 1 ميكروليتر RNasin به آن اضافه كرده و 30 دقيقه در 37 درجه انكوبه كنيد.
- كميت پروب توليد شده شبيه DNA probe تعيين ميشود فقط براي تهيه بافر II ازDEPC treated water استفاده شود
- از RNA نشاندار شده موجود در كيت براي مقايسه پروبها استفاده كنيد.
Hybridization
روش دات بلات
- مدت 5 دقيقه غشانايلوني را در محلول Denaturing قرار دهيد تا DNA دناتوره شود.
( لازم به ذكر است كه نايلون نبايد در محلول شناور شود بلكه بايد ته ظرف يا سيني يك لايه كاغذ خشك كن قرار داده شود سپس محلول را روي كاغذ ريخته بطوري كه فقط كاغذ خيس شود وسپس نايلون را روي آن قرار دهيد.
ـ 5 دقيقه غشارا مانند مرحله قبل در محلول Neutralizing قرار دهيد تا.غشا خنثي شده و از شكنندگي آن جلوگيري شود.
- غشا را روي كاغذ خشك كن قرار داده و هنگا ميكه هنوز مرطوب است DNA را باUV Cross Linker روي أن ثابت كنيد.
ـ غشا در اين مرحله آماده است هم ميتوان براي مدتي آن را نگهداري نمود و هم ميتوان پروسه Hybridization را دنبال نمود.
روش ساترن بلات
ـ وقتي الكتروفورز انجام شد ژل رابا UV مشاهده كرده وبراي جلوگيري از اصراف مواد قسمتهائي از ژل را كه مورد استفاده نيست حذف كند( ژل را Trim كنيد) .
- گوشه( يكي از گوشه‌ها ) ژل را علامت گذاري كرده و سپس 90 دقيقه در حرارت اتاق آن را داخل محلول Denaturing دوران دهيد تا DNA دناتوره شود (0.4N NaOH) البته DNA هاي سنگين تراز15kb را بايد با محلول0.25 M اسيد كلريدريك Depurinate نمود تا بتوانند از ژل روي غشا منتقل شوند (اين كار همراه باshaking انجام شود).
-واكنش را 20 دقيقه در حرارت اتاق در محلول Neutratizing قرار دهيد ( همراه باshakingانجام گيرد).
- غشا (Nylon membrane) رابه اندازه ژل بريده و گوشه آن را مانند ژل علامت گذاري كرده و سپس در آب ديونيزه آن را خيس كنيد.( 98).
- بعد از آماده كردن تا نك انتقال (Transfer Tank) يك قطعه كاغذ صافي روي سيني تا نك قرار دهيد.
- كاغذ صافي را حتما" بابافرتا نك خيس كنيد كه حباب هوا در آن قرار نگيرد .
- يك لايه كاغذ واتمن3MM روي آن قرار دهيد بطوري كه دو سر كاغذ دربا فرتا نك قرار گيرد.
- ژل رابصورت وارونه( نسبت به موقعي كه الكتروفورز ميشود ) روي كاغذ واتمن قرار داده بطوري كه زير ژل حباب هوا قرار نگيرد.
- نايلون آماده شده را روي ژل قرار دهيد بطوريكه هوا زير آن نفوذ نكند.
ـ يك لايه كاغذ واتمن روي فيلتر قرار دهيد.
- اطراف آن را با پارافيلم خوب بپوشانيد.
ـ يك لايه كاغذ صافي و سپس چندين لايه كاغذ خشك كن روي آن قرار دهيد بطوري كه مايع را جذب كند.
- يك صفحه شيشه اي روي آن قرار دهيدويك وزنه 500 گرمي روي شيشه مستقركنيد.
- اطراف تا نك را با نايلون بپوشانيد كه تبا دل هوا با خارج انجام نگيرد واز تبخيربافرتا نك ممانعت نمايد.
- براي بافرتا نك از محلول 0.4N NaOH استفاده كنيد زيرا براي Nylon بهتر از كاغذ نيتروسلولز ميباشدو موجب دناتوره شدن و ثابت شدن DNA روي نايلون ميشود.
- مدت 24 ـ4 ساعت در هواي اتاق قرار دهيد.
- نايلون را خارج كرده و با 2X SSC بشوئيد تا ذرات ژل ازروي آن حذف شوند.
- وقتي نايلون هنوز نمدار است DNA را با دستگاه UV crosslinker روي آن ثابت كنيد.
Pre hybridization ( دات بلات يا'ساترن بلات )
ـ غشارا داخل كيسه پلاستيكي (Hybridization bag) قرارداده ومقدار 20ml/100cm2 محلول Prehybridization داخل كيسه ريخته و سپس آن را خوب درز گيري كنيد بطوريكه مايع از آن نفوذ نكند( seal شود).
ـ مدت 2- 5/1 ساعت در 42 درجه قراردهيد( براي ريبوپروب حرارت 50 درجه درنظرگرفته شود )
ـ پروب را مدت 5 دقيقه درآب جوش قرار داده تا دناتوره شود
- بلافاصله روي يخ حاوي نمك قرار دهيد.
ـ يكي از گوشه هاي كيسه پلاستيكي حاوي nylon را بريده و آن را روي كاغذ خشك‌كن قرار داده و با چرخانيدن يك مداد يا ميله شيشه‌اي گرد روي آن , محلول Prehyridization را از آن خارج كنيد.
- مقدار 2.5ml/100cm2 پروب مخلوط شده با محلول Hybridization وارد كيسه كنيد.
- هواي آن را خارج كرده دوباره آن را seal كنيد.
- مدت يك شب آن را در 42 درجه قرار دهيد. ( براي ريبوپروب 50.درجه).
Post hybridization
- مدت 5 دقيقه بامحلول2XSSC , 1% SDS همراه shaking در حرارت اطاق نايلون را بشوئيد.
- مدت 15 دقيقه بامحلول 2XSSC , 1% SDS آن را يشوئيد (RT)
- مدت 30 دقيقه بامحلول 2XSSC , 1% SDS در65 درجه شستشو دهيد.
- Detection آن شبيه پروب انجام ميگيرد.
هيبريديزاسيون با Riboprobe
- مراحل Dot blot يا Southern blot شبيه DNA پروب انجام ميگيرد.
ـ دماي Hybridization را 50 درجه درنظربگيريد.
– بهتر است پروب (RNA) را هنگام استفاده مدت 5 دقيقه در آب جوش قرار دهيد تا چنانچه RNAدايره (Loop) تشكيل داده است باز شود.
ـ مراحل شستشو و Detection نيز شبيه DNA انجام ميگيرد.
ـ بايد دقت نمود كه حين پروسه كار Rnase وارد محيط نشود وازتما'س دست يا با وسايل كار و نمونه خودداري شود.
- حتما" از دستكش استفاده كنيد
- وسايل شيشه‌اي، تيپها و محلول‌هارا با يد از آلوده شدن با RNase محافظت نمود.
- موادووسايل كاربا RNA بايد از وسايل و مواد ديگر جداباشند. وسايل شيشه‌اي بعد از شستشوبا يد در محلول 1/0درصدDEPC شناور شوند و سپس اتوكلاو گردند وبعد از آن‌بمدت 3 ساعت در250 درجه قرار گيرند.
تيپها ، لوله‌هاي سانتريفيوژ و لوله‌هاي فالكن فاقد RNase ميباشند ولي با يداتوكلاو شوند.
DEPCماده مهار كننده غير اختصاصي ريبونوكلئاز ميباشد كه با آدنين موجود درRNA واكنش ميدهد.
تهيهDeionized formamide
روش كار:
- كاتيون و آنيون( از هر كدام 5 گرم) جداگا نه بايك ليترآب Equilibrate ميشوند. بعد از مخلوط شدن محلول ابري مانند تشكيل ميگردد .اين محلول را با دستگاه فيلتراسيون در خلا فيلتر( كاغذ صافي واتمن ) كرده تا آب رزين خارج شده و رزين روي فيلتربا قي بماند و خشك شود سپس با يك ليتر فرماميد 30 دقيقه روي همزن ميچرخد تا خوب مخلوط شود .محلول دو باره با دستگاه فيلتراسيون درخلا با كاغذ صافي واتمن فيلتر ميشود بطوري كه يك محلول صاف تشكيل ميگردد.اين محلول Deionized Formamideدر يخچال نگهداري ميشود.
طرزتهيه بافرها:
1- بافرI:
Tris (PH:7.5) 100mM
NaCl 500mM
2- بافرII :
(1-3% BSA (blocking reagent كه در بافر I 65درجه حرارت داه ميشود تا حل شود
3- بافر III:
Tris (pH:9.5) 100mM
NaCl 100mM
MgCl2 50mM
ب) بافرهاي Hybridization :
1- بافر Pre hybridization:
Deionized formamide 50%
SSC 5X
Denhardts 5X
hosphate buffer 50mM
SS DNA 125mg/ml
2- بافر Hybridization :
Deionized formamide 50%
SSC 5X
Denhardts 1X
Phosphat buffer 20mM
SS DNA 25mg/ml
Dextran sulfate 10%
3- محلول Denhardts :
BSA 1%
Ficoll 1%
Polyvinyl pyrolidone 1%
4- با فر 20X SSC :
NaCl 3M
Na Citrate 3M
pH: 7
منبع:http://www.iranbiotech.com
/س
