انتقال T-DNA از آگروباکتریوم به سلول‌های گیاهی
همان طور که در مطالب پیشین ذکر شد، بسیاری از پروتیین‌هایی که توسط ژن‌های vir رمز می‌شوند، نقشی ضروری در فرآیند انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم دارند. برخی از این نقش‌ها در چندین مقاله مروری برجسته شرح داده شده است، بنابراین در مقاله حاضر، نقش‌های پروتیین‌های Vir که می‌توانند با هدف بهبود فرآیند انتقال ژن مورد دست‌ورزی قرار گیرند، به طور محدودتری توضیح داده شده است. پروتیین‌های VirA و VirG به عنوان عضوی از یک سیستم تنظیمی ژنتیکی دو بخشی حسی-ترارسانی پیام عمل می‌کنند. VirA یک شاخک پری‌پلاسمیک است که حضور ترکیبات فنلی گیاهی خاصی را در زمان زخم القا می‌شود، حس می‌کند. VirA با هماهنگی با یک مولکول حامل مونوساکاریدی به نام ChvE و در حضور مقدار مناسبی فنل و مولکول قند، خود و پروتیین VirG را فسفریله می‌کند. VirG در حالت غیر فسفریله غیرفعال است، اما در حالت فسفریله، این پروتیین به فعال شدن یا افزایش سطح رونویسی ژن‌های vir کمک می‌کند. این کار احتمالاً از طریق برهمکنش با توالی جعبه-vir که بخشی از راه‌انداز ژن‌های vir است، صورت می‌گیرد. پروتیین‌های همیشه فعال VirA و VirG که نیازی به القا‌کننده فنلی برای فعالیت خود نداشته یا پروتیین‌های VirG که برهمکنش بهتری با توالی جعبه-vir برای فعال کردن ابراز ژن‌های vir داشته باشند، شاید برای بهبود کارآیی انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم و طیف میزبانی مفید باشد.
VirD۴ به همراه ۱۱ پروتیین VirB، یک سیستم ترشحی نوع ۴ که برای انتفال T-DNA و چند پروتیین دیگر Virشامل VirE۲ و VirF لازم است، می سازند. شـایـد VirD۴ بـه عنــوان یـک پیونـددهنـده عمـل نمـایـد تـا برهمکنــش مـجـمـوعـه T-DNA/VirD۲ با سیستم ترشحی رمزشده VirB را افزایش دهد. بیشتر پروتیین های VirB یا کانال غشایی می سازند یا به عنوان ATPase، انرژی لازم برای تشکیل کانال یا فرآیندهای خروج مولکول ها را فراهم می کنند. چندین پروتیین شامل VirB۲، VirB۵ و احتمالاً VirB۷ در ساختن T-pilus شرکت دارند. VirB۲ اصلی ترین پروتیین پیلین است. عمل پیلوس در انتقال T-DNA هنوز روشن نیست، ولی شاید به عنوان کانالی برای عبور T-DNA و پروتیین های Vir عمل نماید یا شاید فقط به عنوان قلابی برای برقراری ارتباط با سلول گیاهی پذیرنده عمل نمایند و باکتری و گیاه در نزدیکی هم قرار داده تا انتقال مولکولی موثری صورت گیرد. جنبه مهم زیست شناسی پیلوس که شاید در انتقال ژن اهمیت داشته باشد، ناپایداری آن در حرارت است. گرچه حداکثر القا ژن های vir در دمای ۲۵ تا ۲۷ درجه است، پیلوس برخی از سویه های آگروباکتریوم در دماهای پایین تر (۱۸ تا ۲۰ درجه)، پایدارتر است. آزمایش های اولیه حاکی از اثر درجه حرارت بر انتقال ژن است. بدین ترتیب، برخی شاید کشت همزمان آگروباکتریوم و سلول های گیاهی را در دمای پایین و طی چند روز آغازین فرآیند انتقال ژن مورد بررسی قرار دهند.
پروتیین های VirD۲ و VirE۲نقشی حیاتی و احتمالاً کامل کننده در انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم بازی می کنند. گفته می-شود که این دو پروتیین به همراه رشته T، مجموعه ای به نام مجموعه T تشکیل می دهند که شکل انتقال شونده T-DNA می-باشد. اینکه این مجموعه داخل باکتری سوار می شود یا نه هنوز مورد مباحثه است. Citovsky و همکارانش نشان داده اند که VirE۲ می تواند داخل سلول گیاهی کار خود را انجام دهد: گیاهان تراریخته توتون که توانایی ابراز VirE۲ را کسب کرده بودند، با سویه های جهش یافته virE۲ آگروباکتریوم آلوده می شدند. چندین آزمایشگاه نیز نشان داده اند که VirE۲ می تواند در غیاب رشته T به سلول گیاهی منتقل شود و ممکن است که مجموعه VirE۲ و رشته T، یا در کانال انتقال باکتری یا داخل سلول گیاهی تشکیل شوند. نتایج تحقیقات جدید حاکی از آن است که شاید VirE۲ نقش دیگری نیز در مراحل اولیه فرآیند انتقال ژن دارد: Dumas و همکارانش نشان داده اند که VirE۲ در شرایط in vitro می تواند با مشارکت غشا مصنوعی، کانالی برای انتقال مولکول های DNA خلق نمایند. بنابراین، ممکن است که یک وظیفه VirE۲، تشکیل سوراخی در غشا سیتوپلاسمی برای تسهیل عبور رشته T باشد. به دلیل اتصال VirD۲ به انتهای ۵′ رشته T، این پروتیین ممکن است به عنوان راهنمای این رشته برای عبور از کانال انتقالی نوع ۴ عمل نماید. VirD۲ همچنین ممکن است در مراحل دیگری از فرآیند انتقال ژن، در داخل سلول گیاهی، نقش داشته باشد. VirD۲ دارای توالی “پیام مکان یابی هسته ای” (NLS) بوده که ممکن است در هدایت این پروتیین و T-DNA متصل به آن به سوی هسته سلول گیاهی، کمک نماید. توالی NLS در پروتیین VirD۲ می تواند مجموعه های T ساخته شده در آزمایشگاه که شامل پروتیین های گزارشگر نیز می باشند، به هسته سلول های گیاه، جانور و مخمر هدایت کند. از این گذشته، VirD۲ می تواند با چندین پروتیین Importin آرابیداپسیس از طریقی وابسته به NLS در مخمر و همچنین شرایط in vitro مشارکت نماید. Importin- بخشی از یکی از مسیرهای انتقال پروتیین هسته ای است که در یوکاریوت ها کشف شده است. داده های اخیر نشان می دهد که VirD۲ به تنهایی برای انتقال مستقیم رشته T به هسته کافی نیست. Ziemienowicz و همکارانش نشان دادند که در سلول های تراوا، VirD۲ می تواند در انتقال اولیگونوکلیوتیدهای کوچـک متصل به خـود، که در شرایـط in vitro ساخته شده اند، به هسته موثر باشد، ولی نمی تواند مولکول های بزرگ متصل را در انتقال به هسته هدایت کند. برای انتقال این مولکول های بزرگ تر، VirE۲ نیز باید به رشته T ملحق شود. نهایتاً شاید VirD۲ نقشی در ادغام T-DNA با ژنوم گیاهی بازی کند. جهش های متعددی در VirD۲ می تواند هم در کارآیی و هم در دقت ادغام T-DNA تاثیر داشته باشند.
درباره نقش VirE۲ در انتقال هسته ای T-DNA هم مباحثاتی وجود دارد. VirE۲ یک پروتیین متصل شوند به توالی های غیر اختصاصی DNA تک رشته می باشد. در سلول های آگروباکتریوم VirE۲ شاید با VirE۱ برهمکنش داشته باشد و بنابراین نمی تواند برای اتصال به T-DNA در دسترس باشد. اما وقتی به DNA تک رشته متصل شود (احتمالاً در سلول گیاهی)، VirE۲ می تواند DNA با ساختار پیچیده اتفاقی را تبدیل به حالتی شبیه به سیم پیچیده تلفن نماید. این شکل طویل شده T-DNA، ممکن است به هدایت آن از طریق سوراخ های هسته کمک نماید. VirE۲ همچنین دارای توالی های NLS بوده که ابه این دلیل می تواند پروتیین های گزارشگر متصل به خود را به هسته سلول گیاه هدایت کند. VirE۲ مثل VirD۲ با پروتیین-های Importin- آرابیداپسیس در مخمر، از طریقی وابسته به NLS برهمکنش دارد. یک گزارش حاکی از آن است که VirE۲ به DNA تک رشته متصل شده و با ریز-تزریقی به داخل سلول گیاهی، می تواند DNA را به هسته هدایت کند، گرچه گزارش-های دیگر نشان می دهد که VirE۲ نمی تواند DNA تک رشته متصل به خود را به هسته سلول های گیاهی یا جانوری که برای افزایش کارآیی جذب DNA از محیط، تراوا گشته اند، رهنمون سازد. دلایل این نتایج متناقض نامعلوم است ولی شاید منعکس-کننده تفاوت های نوع سلول ها و سیستم های ارسال DNA که توسط دو گروه استفاده شده، باشد. استفاده از سویه های آگروباکتریوم که یک پروتیین VirD۲ جهش یافته فاقد NLS را رمز می کنند، برای ارسال T-DNA به سلول گیاهی، فقط باعث ۴۰ درصد کاهش کارآیی انتقال ژن می شود. گیاهان تراریخته که VirE۲ را ابراز می کنند، مکمل سویه های جهش یافته های دوگانه آگروباکتریوم هستند که فاقد ژن virE۲ و دارای یک نقص در ناحیه رمزکننده NLS ژن virD۲ می باشند. این نتایج نشان می دهد که در صورت فقدان توالی NLS در پروتیین VirD۲، سایر سازوکارهای هدف گیری هسته (مثل VirE۲) جایگزین آن می شوند.
وقتی VirE۲ به DNA متصل می شود، موتیف NLS آن مسدود و غیرفعال می شود. این موضوع به این علت است که دامنه NLS و دامنه متصل شونده به DNA پروتیین VirE۲ با هم همپوشانی دارند. گروه Hohn نظریه ای ارایه کرده اند که طبق آن نقش اولیه VirE۲ در انتقال هسته ای مستقل از NLS بوده و VirE۲ فقط به رشته T شکل می دهد تا بتواند از منافذ هسته با حرکات مارپیچی عبور کند.
توانایی پروتیین VirE۲ در مکان یابی هسته سلول های جانوری مورد بحث است. Ziemienowicz و همکارانش نشان داده اند که در سلول های تراوا شده Hela، نوع octopine پروتیین VirE۲ می تواند هسته را هدف گیری نماید در حالی که در سلول های Drosophila و Xenopus که مورد ریزتزریقی قرار گرفته بودند، توالی NLS نوع nopaline پروتیین VirE۲ باید تغییر نماید تا این پروتیین تغییریافته در مکان یابی هسته ای موثر باشد. گرچه دلیل این اختلاف مشخص نیست ولی احتمالاً به خاطر این نیست که یکی از دو گروه از VirE۲ نوع octopine و دیگری از نوع nopaline استفاده کردند.
نهایتاً VirE۲ احتمالاً رشته T را از تجزیه نوکلیوتیدی در سیتوپلاسم و هسته گیاه محافظت می کند.
وجود یک مجموعه T مرکب از یک تک مولکول VirD۲ که با پیوند کووالانت به انتهای ۵′ یک رشته T متصل شده است و به طور منظم توسط مولکول های VirE۲ پوشیده شده است، به طور کلی توسط مجامع تحقیقاتی آگروباکتریوم پذیرفته شده است. اما بهتر است آگاه باشیم که این مجموعه تاکنون نه در آگروباکتریوم و نه در سلول های گیاهی شناسایی نشده است. همچنین ممکن است سایر پروتیین ها مثل Importin، VIP۱ و حتی VirF، هم به طور مستقیم و غیر مستقیم با رشته T برهمکنش داشته و مجموعه T طویل تری در سلول گیاهی تشکیل دهند.
گرچه عموماً ژن هایvir رمز شونده توسط پلاسمید Ti به عنوان مهم ترین عامل انتقال ژن مورد توجه هستند، بسیاری از ژن های کروموزومی آگروباکتریوم نیز برای این فرآیند ضروری هستند. نقش ژن های کروموزومی برای اولین بار با استفاده از جهش زایی اتفاقی کل ژنوم آگروباکتریوم مشخص شد. تحقیقات بعدی نقش بسیاری از این ژن ها را مشخص کرد. این نقش ها شامل تولید، تغییر و ترشح اگزو-پلی ساکارید (pscA/exoC، chvA و chvB) و دیگر نقش ها در اتصال باکتری به سلول های گیاهی (ژن-های att)، ناقلین قند درگیر در القا ژن های vir (chvE)، تنظیم القا ژن های vir (chvD) و حمل T-DNA (acvB) می باشد. ژن های دیگر مثل miaA، نیز ممکن است نقش کوچکی در فرآیند انتقال ژن داشته باشند. روشن شدن توالی کامل A. tumefaciens C۵۸، مطمیناً بستر مناسبی برای کشف ژن های دیگری که در انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم درگیر هستند، فراهم می کند.
منبع:http://www.academist.ir
VirD۴ به همراه ۱۱ پروتیین VirB، یک سیستم ترشحی نوع ۴ که برای انتفال T-DNA و چند پروتیین دیگر Virشامل VirE۲ و VirF لازم است، می سازند. شـایـد VirD۴ بـه عنــوان یـک پیونـددهنـده عمـل نمـایـد تـا برهمکنــش مـجـمـوعـه T-DNA/VirD۲ با سیستم ترشحی رمزشده VirB را افزایش دهد. بیشتر پروتیین های VirB یا کانال غشایی می سازند یا به عنوان ATPase، انرژی لازم برای تشکیل کانال یا فرآیندهای خروج مولکول ها را فراهم می کنند. چندین پروتیین شامل VirB۲، VirB۵ و احتمالاً VirB۷ در ساختن T-pilus شرکت دارند. VirB۲ اصلی ترین پروتیین پیلین است. عمل پیلوس در انتقال T-DNA هنوز روشن نیست، ولی شاید به عنوان کانالی برای عبور T-DNA و پروتیین های Vir عمل نماید یا شاید فقط به عنوان قلابی برای برقراری ارتباط با سلول گیاهی پذیرنده عمل نمایند و باکتری و گیاه در نزدیکی هم قرار داده تا انتقال مولکولی موثری صورت گیرد. جنبه مهم زیست شناسی پیلوس که شاید در انتقال ژن اهمیت داشته باشد، ناپایداری آن در حرارت است. گرچه حداکثر القا ژن های vir در دمای ۲۵ تا ۲۷ درجه است، پیلوس برخی از سویه های آگروباکتریوم در دماهای پایین تر (۱۸ تا ۲۰ درجه)، پایدارتر است. آزمایش های اولیه حاکی از اثر درجه حرارت بر انتقال ژن است. بدین ترتیب، برخی شاید کشت همزمان آگروباکتریوم و سلول های گیاهی را در دمای پایین و طی چند روز آغازین فرآیند انتقال ژن مورد بررسی قرار دهند.
پروتیین های VirD۲ و VirE۲نقشی حیاتی و احتمالاً کامل کننده در انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم بازی می کنند. گفته می-شود که این دو پروتیین به همراه رشته T، مجموعه ای به نام مجموعه T تشکیل می دهند که شکل انتقال شونده T-DNA می-باشد. اینکه این مجموعه داخل باکتری سوار می شود یا نه هنوز مورد مباحثه است. Citovsky و همکارانش نشان داده اند که VirE۲ می تواند داخل سلول گیاهی کار خود را انجام دهد: گیاهان تراریخته توتون که توانایی ابراز VirE۲ را کسب کرده بودند، با سویه های جهش یافته virE۲ آگروباکتریوم آلوده می شدند. چندین آزمایشگاه نیز نشان داده اند که VirE۲ می تواند در غیاب رشته T به سلول گیاهی منتقل شود و ممکن است که مجموعه VirE۲ و رشته T، یا در کانال انتقال باکتری یا داخل سلول گیاهی تشکیل شوند. نتایج تحقیقات جدید حاکی از آن است که شاید VirE۲ نقش دیگری نیز در مراحل اولیه فرآیند انتقال ژن دارد: Dumas و همکارانش نشان داده اند که VirE۲ در شرایط in vitro می تواند با مشارکت غشا مصنوعی، کانالی برای انتقال مولکول های DNA خلق نمایند. بنابراین، ممکن است که یک وظیفه VirE۲، تشکیل سوراخی در غشا سیتوپلاسمی برای تسهیل عبور رشته T باشد. به دلیل اتصال VirD۲ به انتهای ۵′ رشته T، این پروتیین ممکن است به عنوان راهنمای این رشته برای عبور از کانال انتقالی نوع ۴ عمل نماید. VirD۲ همچنین ممکن است در مراحل دیگری از فرآیند انتقال ژن، در داخل سلول گیاهی، نقش داشته باشد. VirD۲ دارای توالی “پیام مکان یابی هسته ای” (NLS) بوده که ممکن است در هدایت این پروتیین و T-DNA متصل به آن به سوی هسته سلول گیاهی، کمک نماید. توالی NLS در پروتیین VirD۲ می تواند مجموعه های T ساخته شده در آزمایشگاه که شامل پروتیین های گزارشگر نیز می باشند، به هسته سلول های گیاه، جانور و مخمر هدایت کند. از این گذشته، VirD۲ می تواند با چندین پروتیین Importin آرابیداپسیس از طریقی وابسته به NLS در مخمر و همچنین شرایط in vitro مشارکت نماید. Importin- بخشی از یکی از مسیرهای انتقال پروتیین هسته ای است که در یوکاریوت ها کشف شده است. داده های اخیر نشان می دهد که VirD۲ به تنهایی برای انتقال مستقیم رشته T به هسته کافی نیست. Ziemienowicz و همکارانش نشان دادند که در سلول های تراوا، VirD۲ می تواند در انتقال اولیگونوکلیوتیدهای کوچـک متصل به خـود، که در شرایـط in vitro ساخته شده اند، به هسته موثر باشد، ولی نمی تواند مولکول های بزرگ متصل را در انتقال به هسته هدایت کند. برای انتقال این مولکول های بزرگ تر، VirE۲ نیز باید به رشته T ملحق شود. نهایتاً شاید VirD۲ نقشی در ادغام T-DNA با ژنوم گیاهی بازی کند. جهش های متعددی در VirD۲ می تواند هم در کارآیی و هم در دقت ادغام T-DNA تاثیر داشته باشند.
درباره نقش VirE۲ در انتقال هسته ای T-DNA هم مباحثاتی وجود دارد. VirE۲ یک پروتیین متصل شوند به توالی های غیر اختصاصی DNA تک رشته می باشد. در سلول های آگروباکتریوم VirE۲ شاید با VirE۱ برهمکنش داشته باشد و بنابراین نمی تواند برای اتصال به T-DNA در دسترس باشد. اما وقتی به DNA تک رشته متصل شود (احتمالاً در سلول گیاهی)، VirE۲ می تواند DNA با ساختار پیچیده اتفاقی را تبدیل به حالتی شبیه به سیم پیچیده تلفن نماید. این شکل طویل شده T-DNA، ممکن است به هدایت آن از طریق سوراخ های هسته کمک نماید. VirE۲ همچنین دارای توالی های NLS بوده که ابه این دلیل می تواند پروتیین های گزارشگر متصل به خود را به هسته سلول گیاه هدایت کند. VirE۲ مثل VirD۲ با پروتیین-های Importin- آرابیداپسیس در مخمر، از طریقی وابسته به NLS برهمکنش دارد. یک گزارش حاکی از آن است که VirE۲ به DNA تک رشته متصل شده و با ریز-تزریقی به داخل سلول گیاهی، می تواند DNA را به هسته هدایت کند، گرچه گزارش-های دیگر نشان می دهد که VirE۲ نمی تواند DNA تک رشته متصل به خود را به هسته سلول های گیاهی یا جانوری که برای افزایش کارآیی جذب DNA از محیط، تراوا گشته اند، رهنمون سازد. دلایل این نتایج متناقض نامعلوم است ولی شاید منعکس-کننده تفاوت های نوع سلول ها و سیستم های ارسال DNA که توسط دو گروه استفاده شده، باشد. استفاده از سویه های آگروباکتریوم که یک پروتیین VirD۲ جهش یافته فاقد NLS را رمز می کنند، برای ارسال T-DNA به سلول گیاهی، فقط باعث ۴۰ درصد کاهش کارآیی انتقال ژن می شود. گیاهان تراریخته که VirE۲ را ابراز می کنند، مکمل سویه های جهش یافته های دوگانه آگروباکتریوم هستند که فاقد ژن virE۲ و دارای یک نقص در ناحیه رمزکننده NLS ژن virD۲ می باشند. این نتایج نشان می دهد که در صورت فقدان توالی NLS در پروتیین VirD۲، سایر سازوکارهای هدف گیری هسته (مثل VirE۲) جایگزین آن می شوند.
وقتی VirE۲ به DNA متصل می شود، موتیف NLS آن مسدود و غیرفعال می شود. این موضوع به این علت است که دامنه NLS و دامنه متصل شونده به DNA پروتیین VirE۲ با هم همپوشانی دارند. گروه Hohn نظریه ای ارایه کرده اند که طبق آن نقش اولیه VirE۲ در انتقال هسته ای مستقل از NLS بوده و VirE۲ فقط به رشته T شکل می دهد تا بتواند از منافذ هسته با حرکات مارپیچی عبور کند.
توانایی پروتیین VirE۲ در مکان یابی هسته سلول های جانوری مورد بحث است. Ziemienowicz و همکارانش نشان داده اند که در سلول های تراوا شده Hela، نوع octopine پروتیین VirE۲ می تواند هسته را هدف گیری نماید در حالی که در سلول های Drosophila و Xenopus که مورد ریزتزریقی قرار گرفته بودند، توالی NLS نوع nopaline پروتیین VirE۲ باید تغییر نماید تا این پروتیین تغییریافته در مکان یابی هسته ای موثر باشد. گرچه دلیل این اختلاف مشخص نیست ولی احتمالاً به خاطر این نیست که یکی از دو گروه از VirE۲ نوع octopine و دیگری از نوع nopaline استفاده کردند.
نهایتاً VirE۲ احتمالاً رشته T را از تجزیه نوکلیوتیدی در سیتوپلاسم و هسته گیاه محافظت می کند.
وجود یک مجموعه T مرکب از یک تک مولکول VirD۲ که با پیوند کووالانت به انتهای ۵′ یک رشته T متصل شده است و به طور منظم توسط مولکول های VirE۲ پوشیده شده است، به طور کلی توسط مجامع تحقیقاتی آگروباکتریوم پذیرفته شده است. اما بهتر است آگاه باشیم که این مجموعه تاکنون نه در آگروباکتریوم و نه در سلول های گیاهی شناسایی نشده است. همچنین ممکن است سایر پروتیین ها مثل Importin، VIP۱ و حتی VirF، هم به طور مستقیم و غیر مستقیم با رشته T برهمکنش داشته و مجموعه T طویل تری در سلول گیاهی تشکیل دهند.
گرچه عموماً ژن هایvir رمز شونده توسط پلاسمید Ti به عنوان مهم ترین عامل انتقال ژن مورد توجه هستند، بسیاری از ژن های کروموزومی آگروباکتریوم نیز برای این فرآیند ضروری هستند. نقش ژن های کروموزومی برای اولین بار با استفاده از جهش زایی اتفاقی کل ژنوم آگروباکتریوم مشخص شد. تحقیقات بعدی نقش بسیاری از این ژن ها را مشخص کرد. این نقش ها شامل تولید، تغییر و ترشح اگزو-پلی ساکارید (pscA/exoC، chvA و chvB) و دیگر نقش ها در اتصال باکتری به سلول های گیاهی (ژن-های att)، ناقلین قند درگیر در القا ژن های vir (chvE)، تنظیم القا ژن های vir (chvD) و حمل T-DNA (acvB) می باشد. ژن های دیگر مثل miaA، نیز ممکن است نقش کوچکی در فرآیند انتقال ژن داشته باشند. روشن شدن توالی کامل A. tumefaciens C۵۸، مطمیناً بستر مناسبی برای کشف ژن های دیگری که در انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم درگیر هستند، فراهم می کند.
منبع:http://www.academist.ir
