در ربع قرن گذشته، فناوری های مهندسی ژنتیک گیاهی پیشرفت چشمگیری داشته است. بارتا و همکارانش اولین کسانی بودند که با استفاده از پلاسمید Ti، ژن کایمریک نوپالین سنتاز و هورمون رشد انسانی را در گیاهان آفتابگردان و تنباکو رونویسی کردند. اندکی پس از آن، آنتی بادی مونوکلونال موش تولید شد و به طور عملکردی در بخش های برگ تنباکو مونتاژ گردید. به عنوان بیوراکتور، گیاهان ممکن است مقادیر بالایی از پروتئین های نوترکیب تولید کنند. این پروتئین ها با پاتوژن های حیوانی یا انسان آلوده نیستند و می توان آن ها را بدون یخچال و با هزینه کم نگهداری کرد.

تعدادی از پروتئین‌های نوترکیب در گیاهان تولید شده‌اند، و تولید داروهای مبتنی بر پروتئین تا حدی از کشت‌های سلولی باکتری، قارچ و پستانداران به گیاهان و کشت‌های سلولی گیاهی تغییر یافته است. واکسن های زیر واحد نوترکیب ایمن تر از واکسن های سنتی هستند، زیرا فاقد پاتوژن زنده هستند. گیاهان مختلفی مانند تنباکو، برنج، ذرت، سیب زمینی، یونجه، کاهو، گوجه فرنگی، هویج، بادام زمینی و سویا به عنوان میزبان برای معرفی ژن مورد استفاده قرار می گیرند که در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از پروتوپلاست یا کشت سلولی یا کشت ریشه مویی به دست می آید. نوترکیبی ژنوم هسته یا کلروپلاست به طور معمول برای بدست آوردن گیاهان تراریخته استفاده می شود. دو گزینه برای تزریق واکسن وجود دارد: تزریق (عضلانی یا زیر جلدی) و تزریق مخاطی (دهانی یا بینی).

واکسن‌های نوع تزریقی با القای ترجیحی تولید IgG، ایمنی محافظتی قوی ایجاد می‌کنند.آن ها در برابر پاتوژن هایی که از طریق سیستمیک یا تنفسی آلوده می شوند مناسب هستند. با این حال، آنتی ژن ها باید قبل از تجویز خالص شوند. این واکسن ها اغلب در گیاهان تنباکو با استفاده از بیان موقت تولید می شوند.

واکسن های خوراکی یا بینی باعث ایجاد ایمنی مخاطی و سیستمیک می شوند. از نظر مفهومی، واکسن های خوراکی مبتنی بر گیاه ایده آل هستند زیرا فرآیند تولید ساده است. هیچ دستگاه پزشکی اضافی برای تزریق مورد نیاز نیست و ایمنی زایی آنتی ژن و فعالیت های بیولوژیکی در دستگاه گوارش به دلیل پوشش زیستی طبیعی آن ها در اندامک سلول گیاهی حفظ می شود.

واکسن های خوراکی مبتنی بر گیاه در گیاهان خوراکی از جمله برنج، ذرت، سیب زمینی، کاهو و هویج ساخته شده است. هنگامی که این واکسن ها از محیط معده عبور می کنند و به روده کوچک می رسند، آنتی ژن ها به سلول های M در اپیتلیوم مرتبط با فولیکول (FAE) برای القای پاسخ های ایمنی مخاطی و سیستمیک وارد می شوند. در این مقاله با واکسن های گیاهی آشنا شوید.

فناوری های نوترکیب

برای استفاده از گیاهان به‌عنوان بیوراکتور برای واکسن‌های تجاری، باید موارد زیر را در نظر گرفت:

باید بتوانیم به سطح بیان بالایی از ژن‌های نوترکیب دست یابیم.
قادر به طراحی و تولید سریع و آسان آنتی‌ژن‌های جدید در پاسخ به زیرگروه‌های پاتوژن جدید باشیم
شناسایی ژن هایی که باید ترانسفکت شوند و ایمنی پروتئین های تولید شده را برای استفاده در انسان یا حیوان تضمین می کند.

انتقال ژن به هسته مبتنی بر آگروباکتریوم

فناوری های نوترکیب گیاهی به طور مداوم در حال بهبود و تنوع هستند (تصویر 1). ژن ها را می توان به صورت مستقیم یا با استفاده از باکتری گرم منفی Agrobacterium tumefaciens وارد گیاهان کرد. انتقال ژن به گیاه با پلی اتیلن گلیکول یا الکتروپوراسیون معمولاً شامل آماده سازی پروتوپلاست با حذف دیواره سلولی است که به زمان و مهارت نیاز دارد. تقریباً نیمی از فناوری‌های تبدیل گیاه از A. tumefaciens استفاده می‌کنند که به طور طبیعی گیاهان را آلوده می‌کند.

ناحیه T-DNA بین مرزهای چپ و راست پلاسمید Ti A. tumefaciens به ژنوم گیاه وارد شده و در سلول گیاه رونویسی می شود. این فرآیند باعث تولید غیرطبیعی هورمون گیاهی و در نتیجه بیماری گال طوقه می شود. منطقه T-DNA را می توان با یک ژن مورد نظر جایگزین کرد و پلاسمید Ti به یک ناقل دوتایی تغییر یافته است که می تواند در اشریشیا کلی دستکاری شود. فشار انتخاب برای ایجاد یکپارچگی پایدار ژن مورد نظر در ژنوم هسته ای استفاده می شود.

هنگامی که خط تراریخته که پروتئین هدف را به طور پایدار تولید می کند، ایجاد می شود، می توان از آن به عنوان منبع دائمی واکسن استفاده نمود. با این حال، توسعه چنین خطوطی زمان‌بر است و می‌تواند با خاموش شدن ژن، آسیب ژنوم میزبان یا هیبریداسیون با محصولات غیرتراریخته، پیچیده شود.

تصویر 1: فناوری های انتقال ژن به گیاهان (مزایا و معایب آن ها)

انتقال ژن به پلاستید

فناوری جدیدی که به جای ژنوم هسته ای، ژنوم کلروپلاست را هدف قرار می دهد، اکنون در دسترس است. کلروپلاست ها از سیانوباکتری هایی که در جلبک ها گنجانده شده اند منشاء می گیرند. کلروپلاست و ژنوم هسته‌ای با هم تکامل یافتند و اکنون ژنوم‌های کلروپلاست تنها دارای 100 تا 250 ژن هستند که کوچک‌تر از ژنوم‌های هسته‌ای است.

ژنوم کلروپلاست از طریق مادر به ارث می رسد و گیاهان می توانند پروتئین را بدون عبور ژن از طریق گرده به طور پایدار تولید کنند. کلروپلاست های متعدد با تعداد کپی تراریخته بالا می توانند مقادیر زیادی پروتئین نوترکیب (به اندازه 70 درصد کل پروتئین برگ) را جمع آوری کنند.

ژن‌های خارجی معمولاً با فرآیند بیولیستی (تفنگ ژنی) یا عملیات پلی‌اتیلن گلیکول پروتوپلاست‌ها به DNA کلروپلاست تبدیل می‌شوند. برای انتقال ژن به پلاستید، یک ژن هدف و ژن‌های نشانگر قابل انتخاب بین دو توالی کناری منشأ گرفته از ژنوم کلروپلاست قرار می‌گیرند تا نوترکیبی همولوگ بین ژنوم ناقل و پلاستید ایجاد کنند.

کلروپلاست های تنباکو و سایر گیاهان برگدار مانند هویج، گل اطلسی و کاهو عمدتاً مورد استفاده قرار گرفته اند. اندام های گیاهی غیر فتوسنتزی کارایی کمتری در تولید پروتئین های هدف دارند.

بیان موقت با وکتورهای بیان ویروس گیاهی

مزیت بیان موقت با استفاده از وکتورهای ویروسی گیاهی، توانایی تکثیر بالای آن ها در گیاه هدف است که در نتیجه عملکرد واکسن بالایی دارد. چندین ویروس گیاهی برای این منظور استفاده می شود: ویروس موزاییک تنباکو (TMV)، ویروس موزاییک لوبیا چشم بلبلی (CPMV)، ویروس سیب زمینی (PVX)، ویروس موزاییک یونجه و ویروس آبله آلو.

ژن کد کننده پروتئین یا پپتید مورد نظر در پایین دست ژن های پلیمراز ویروسی، پروتئین حرکتی و پروتئین پوششی قرار می گیرد. این فناوری برای تولید واکسن‌های مختلف گیاهی، مانند واکسن‌های ضد ویروس پاپیلومای انسانی و ویروس آنفولانزا، با اصلاح PVX یا TMV و واکسن علیه نوروویروس با اصلاح TMV استفاده شده است.

ناقل های ویروسی نسل دوم که در محیط های طبیعی ایمن هستند، ساخته شده اند. این ناقل ها به یک سیستم یکپارچه متکی هستند که دارای حداقل تعداد عناصر ویروسی مورد نیاز برای همانندسازی است، در حالیکه سایر عملکردها، مانند تحویل DNA، توسط عناصر غیر ویروسی ارائه می شودکه معمولاً بازدهی بالاتری نسبت به استفاده ویروس ازکامل را ارائه می‌کنند.

واکسن های انسانی در آزمایشات بالینی

فقط تعداد کمی از واکسن های انسانی مبتنی بر گیاه به آزمایشات بالینی رسیده اند. زیرواحد B غیر سمی از انتروتوکسین حساس به حرارت (LTB) متعلق به انتروتوکسیژن اشیرشیا کلای (ETEC) تولید شده در سیب زمینی یا ذرت به صورت خوراکی به داوطلبان سالم برای بررسی ایمنی آن تجویز شد. غده‌های سیب‌زمینی تراریخته خام، خرد شده حاوی LTB (0.4 یا 1.1 میلی‌گرم) در روزهای 0، 7 و 21 به داوطلبان داده شد. کنجاله جوانه ذرت تراریخته یا نوع وحشی معلق در آب در روزهای 0، 7 و 21. هیچ گونه عوارض جانبی واکسیناسیون در مقایسه با گروه شاهد مشاهده نشد. سلول های ترشح کننده IgA اختصاصی LTB یک هفته پس از اولین واکسیناسیون در خون محیطی شناسایی شدند.

بررسی سرولوژیکی نشان داد که داوطلبان واکسینه شده سطوح IgG سرم اختصاصی LTB (91٪ از داوطلبان) و IgA (55٪) را در روز 59 افزایش دادند. پروتئین کپسید نوروویروس VP1 به همان روش LTB در غده های سیب زمینی تولید شد. از آنجایی که نوروویروس یک ویروس بدون پوشش است، VP1 تنها پروتئین کپسید است. واکسیناسیون با تقریباً 500 میکروگرم VP1 نوترکیب در روزهای 0، 7 و 21 (سه دوز) یا در روزهای 0 و 21 (دو دوز) انجام شد. برخی از داوطلبان قبل از مطالعه آنتی‌بادی‌های اختصاصی VP1 داشتند (زیرا نوروویروس بسیار عفونی است و اپیدمی‌های مکرر به ویژه در زمستان شایع است). با این حال، 20 درصد از داوطلبان واکسینه شده، تیترهای IgG سرم اختصاصی VP1 را ایجاد کردند.

میانگین هندسی تیترهای IgG (چهار پاسخ دهنده) قبل از واکسیناسیون 1:67 و بعد از واکسیناسیون 1:757 بود. طبق گزارش سازمان جهانی بهداشت، سالانه 780-000 نفر در سراسر جهان بر اثر عفونت HBV جان خود را از دست می دهند. در مناطق مختلف، 1-10٪ از جمعیت بزرگسال به طور مزمن به HBV آلوده هستند، در حالی که 80-90٪ از نوزادان زیر 6 ماه مبتلا به عفونت های مزمن هستند که منجر به سیروز یا سرطان کبد می شود. آنتی ژن سطحی HBV (HBsAg) در گیاهان تولید شد. برگ های تراریخته کاهو HBsAg (0.1-0.5 میکروگرم HBsAg در هر 100 گرم بافت تازه) به داوطلبان بالغ داده شد (در ابتدا 200 گرم، سپس 150 گرم در عرض 2 ماه). دو نفر از سه داوطلب واکسینه شده سطوح محافظتی موقت از IgG اختصاصی HBsAg (بالاتر از IU/l 10) را دو هفته پس از واکسیناسیون دوم نشان دادند، اما هیچ IgA سرمی اختصاصی HBsAg مشاهده نشد.

مطالعه بالینی دیگری با HBsAg خوراکی تولید شده در سیب زمینی تراریخته انجام شد. تمام داوطلبانی که در این مطالعه ثبت نام کردند، سه دوز واکسن تزریقی HBV را طی 15 سال دریافت کردند. به گروه دارونما سیب زمینی غیرتراریخته داده شد. نویسندگان دریافتند که 52.9 درصد از شرکت کنندگان در گروه دو-دوز و 62.5 درصد از شرکت کنندگان در گروه سه-دوز، تیتر آنتی بادی HBsAg سرم را طی دوره پیگیری 70 روزه پس از اولین ایمن سازی افزایش دادند. ویروس آنفولانزا دارای 16 زیرگروه هماگلوتینین (HA) است و حتی در سویه‌هایی با زیرگروه یکسان، جابجایی آنتی ژنی اغلب برای از بین بردن ایمنی متقابل محافظتی میزبان رخ می‌دهد. به عنوان مثال، در سال 2009، ویروس آنفلوانزای نوع H1N1 همه گیر شد.

برای کنترل گسترش آن با واکسیناسیون، تولید سریع آنتی ژن HA جدید مورد نیاز بود. شرکت Medicago فناوری تولید VLPهای ویروس آنفولانزا HA در N. benthamiana را با سیستم بیان موقت مبتنی بر A. tumefaciens توسعه داد. VLPها با اندازه مورد انتظار بین غشای پلاسمایی و دیواره سلولی سلولهای N. benthamiana یافت شدند.

یک کارآزمایی بالینی H5-VLP به عنوان یک مطالعه تصادفی، کنترل شده با دارونما و محدوده دوز انجام شد که از 20، 30 یا 45 میکروگرم H5-VLP استفاده کرد. پس از 6 ماه واکسیناسیون با H5-VLP، گروه داوطلب پاسخ متقابل سلول های CD4+ T را نشان دادکه در گروه دارونما مشاهده نشد، که نشان دهنده القای قوی ایمنی طولانی مدت با واسطه سلولی توسط H5-VLP گیاهی است. سطح آنتی بادی ها در اکثر شرکت کنندگان تا 6 ماه به سطح اولیه بازگشت.

توسعه واکسن های دامپزشکی

آنتی ژن های پاتوژن های حیوانی مزرعه در گیاهان بیان شده اند و تعداد کمی از آن ها در گونه های میزبان آزمایش شده اند. اولین واکسن گیاهی مورد تایید وزارت کشاورزی آمریکا برای استفاده دامپزشکی، واکسن بیماری نیوکاسل برای طیور از مرکز USDA برای بیولوژیک دامپزشکی در سال 2006 بود. هماگلوتینین و نورآمینیداز ویروس بیماری نیوکاسل را در سلول های تنباکو کشت شده با سوسپانسیون تولید می کند.

دو دوز زیرجلدی از این واکسن در فاصله 2 هفته ای به جوجه های نوزادی، محافظت 90 درصدی را در برابر چالش ویروس نیوکاسل تضمین می کند. برای حیوانات مزرعه، هزینه ایمن سازی سود حاصل از فروش محصولاتی مانند گوشت، شیر و تخم مرغ را محدود می کند. بنابراین، واکسن‌های گیاهی در صورتیکه بتوان آن‌ها را با هزینه کم تولید کرد، دارایی برای استفاده حیوانات است. علاوه بر این، واکسن های خوراکی نیاز به تلاش کمی برای تجویز دارند.

در طیور، علاوه بر واکسن تایید شده ذکر شده در بالا، گلیکوپروتئین ویروس نیوکاسل در سیب زمینی، تنباکو، ذرت و برنج بیان شده است. ژن گلیکوپروتئین S1 ویروس برونشیت عفونی مرغ (IBV) در سیب زمینی نیز معرفی شده است.

واکسن های گیاهی برای محافظت از خوک در برابر ETEC و ویروس بیماری پا و دهان (FMDV) به خوبی مشخص شده اند. فیمبریاهای ETEC (از نوع F4) در کلروپلاست های یونجه تولید شدند و پس از خشک شدن یونجه و نگهداری در دمای اتاق به مدت 2 سال پایدار ماندند.

پروتئین‌های نوترکیب در ترکیب با سم وبا به‌عنوان یک ادجوانت به صورت داخل معده به خوک‌ها معرفی شدند که منجر به کاهش دفع ETEC در مدفوع آن ها شد. همچنین، واکسن زیرواحد B توکسین وبا بر پایه برنج (CTB) تولید شده است که در برابر سم حساس به حرارت ETEC خوک کارآمد است زیرا توالی اسید آمینه و ترکیب این سم شبیه به توکسین وبا است.

استفاده از برنج تولید کننده CTB، به نام MucoRice-CTB، پایداری آنتی ژن بالا در دستگاه گوارش و القای سیستم ایمنی مخاطی را در مدل موش تضمین کرد.

خروس‌های باردار و خوک‌های کوچک از شیر گرفته شده، IgG و IgA اختصاصی آنتی‌ژن را در سرم‌های خود پس از ایمن‌سازی MucoRice-CTB تولید کردند. MucoRice-CTB همچنین IgG و IgA CTB خاص مادر را در آغوز و شیر خروس‌ها پس از زایش القا کرد. این آنتی‌بادی‌های خاص مادری به خوکچه‌های تازه متولد شده ایمن‌سازی غیرفعال با شیر مصرف شده را ارائه می‌دهند. آنتی‌بادی‌های اختصاصی CTB نیز در مجرای روده خوک‌های از شیر گرفته شده ترشح شد و تجمع مایع حلقه روده در چالش ETEC کاهش یافت که نشان‌دهنده اثر محافظتی MucoRice-CTB در برابر اسهال ETEC است.

بنابراین، MucoRice-CTB می‌تواند یک واکسن خوراکی نامزد برای القای ایمنی غیرفعال و فعال برای محافظت از خوک‌های شیرخوار و از شیر گرفته شده در برابر اسهال ETEC باشد. FMDV خوک‌ها و گاوها را آلوده می‌کند اما انسان را آلوده نمی‌کند و باعث یک بیماری بزرگ حیوانی می‌شود که پیشگیری از آن مستلزم همکاری بین‌المللی است.

دانمشندان VP1 FMDV را بر سطح ویروس موزاییک بامبو در N. benthamiana و Chenopodium quinoa بیان کردند. ویروس موزاییک بامبو بیان کننده VP1 خالص شده به صورت عضلانی با یک ادجوانت روغن به خوکچه های 2 ماهه دو بار با فاصله 6 هفته تزریق شد. تیتر خنثی سازی در تمام خوکچه هایی که 0.5، 1 یا 5 میلی گرم آنتی ژن خالص شده را حتی پس از واکسیناسیون تک دریافت کردند، افزایش یافت.

FMDV VP1 و پلی پروتئین ساختاری P1 تولید شده در تنباکو، سیب زمینی، یونجه یا گوجه فرنگی موش و خوکچه هندی محافظت شده از چالش FMDV. ویروس هاری باعث ایجاد یک بیماری مشترک بین انسان و دام می شود که از حیوانات وحشی مانند خفاش، راکون و روباه به حیوانات خانگی و انسان منتقل می شود.

برای کنترل هاری در انسان، واکسیناسیون حیات وحش و حیوانات خانگی مورد نیاز است. گرفتن تعداد زیادی از حیوانات وحشی برای تزریق واکسن تقریبا غیرممکن است و توزیع طعمه مخلوط با واکسن خوراکی در مناطق در معرض خطر می تواند راه حل اصلی برای کنترل هاری باشد. پروتئین Rabies G در گونه های مختلفی از جمله تنباکو، گوجه فرنگی، اسفناج، هویج و ذرت بیان شده است. ایمن سازی خوراکی با پروتئین G هاری تولید شده در ذرت (0.5-2 میلی گرم) گوسفند را از سویه هاری CASS-88 محافظت کرد.