از کروماتوگرافی چه مي دانيد؟ (2)

نقایص کروماتوگرافی کاغذی
لکه‌های چند تایی :

در کروماتوگرافی یون‌ها فلزی ، اگر دارای آنیونی متفاوت از آنیون موجود در محلول اولیه باشد، ممکن است رقابتی بین آنیون‌ها برای یون فلزی وجود داشته باشد، که در نتیجه دو لکه به دست می‌آید که هر یک از آنها مربوط به یکی از نمکهای فلزی می‌باشد. ممکن است یون فلزی دو کمپلکس متفاوت با حلال ایجاد کند. در جدا سازی‌های آلی ، ممکن است جسم دو شکل متفاوت وجود داشته باشد. به عنوان مثال یک آمینو اسید می‌تواند به صورت کاتیون و یون دو قطبی باشد.

دنباله دار شدن :

اگر مخلوط یه مقدار زیاد از حد روی کاغذ قرار داده شود، یا سرعت عبور حلال متفاوت باشد، جسم نمی‌تواند برای ایجاد یک لکه مجزا به تعادل برسد. در این صورت این لکه ، در سطح بزرگی از کاغذ پخش شده و از حلال در حال پیشروی عقب می‌ماند. دنباله‌دار شدن ممکن است به سبب اثرات جذبی سطحی تر ایجاد شود.

اثرات لبه یا کناره :

لکه‌ها خیلی نزدیک به کنار نوار ، ممکن است در امتداد کنار کاغذ پخش شوند، عمل نفوذ ممکن است به علت بالا بودن غلظت موضعی فاز متحرک در آن ناحیه ، و یا به علت بالاتر بودن سرعت تبخیر حلال در کنار کاغذ ، که منجر به اثرات تقسیمی غیرعادی می‌شوند، باشد.

روش کمی کروماتوگرافی کاغذی

کاربرد کمی این روش نه تنها احتیاج به یک جداسازی کمی ، بلکه مکان‌یابی و ارزیابی کمی اجسام موجود نیز دارد. یک جداسازی کیفی رضایت بخش ، الزاما برای کار کمی مفید نیست. اندازه گیری کمی را می‌توان یا با سنجش مقدار جسم موجود در لکه روی کاغذ ، یا با خارج کردن جسم از کاغذ و تجزیه اجزای جدا شده به وسیله روش‌های کمی متداول انجام داد. لکه اولیه از نمونه مناسب روی کاغذ قرار می‌دهند، خشک کردن لکه باید تحت شرایط استاندارد زمان و دما صورت گیرد.
در تهیه حلال باید دقت زیادی روی نسبت‌های اجزای صورت گیرد، برقرار ساختن تعادل باید به طور استاندارد انجام گیرد، طول عبور حلال در تمامی نوبت‌ها یکسان باشد، در طول آزمایش ، دما باید ثابت بماند، و خشک کردن ورقه باید در یک زمان و دمای استاندارد انجام گیرد. واکنشگر مکان‌یاب (در صورت استفاده از لکه‌های رنگی) باید به طریق کاملا تکرارپذیر افزوده شود. و هر عمل بعدی ، مانند خشک کردن یا قراردادن در معرض بخار آمونیاک ، باید در مدت استاندارد انجام گیرد. مقدار جسمی که در یک جداسازی کروماتوگرافی باید روی کاغذ قرار گیرد، متغیر است.

موارد استعمال کروماتوگرافی کاغذی

منابع علمی مربوط به روش‌های تجزیه‌ای و بررسی ترکیبات طبیعی نشان می‌دهد که کروماتوگرافی کاغذی در هر رشته‌ای کاربرد دارد. با این همه ، این روش هنوز هم در جداسازی‌های مواد با ماهیت زیستی وسیعترین کاربرد را دارد.
کروماتوگرافی کاغذی اکثرا به عنوان یک وسیله تحقیقاتی به کار می‌رود، و به طور گسترده‌ای در تجزیه‌های روزمره مخصوصا در جداسازی‌های جدیدی که هیچ روش کلاسیک برای آنها وجود ندارد، نیز مورد استفاده قرار می گیرد. روش اخیر در مسائل کلینیکی و زیست شیمیایی ، جداسازی اسیدهای آمینه و پپتیدها در بررسی ساختارهای پروتئین کاربد دارد.
آزمایش روزمره ادرار و سایر مایعات بدن برای اسید آمینه و قند ، جداسازی بازهای پورین و نوکلئوتیدها در آزمایش اسیدهای نوکلئیک ، جداسازی استرئیدها ، تجزیه عمومی ، تجزیه بسپارها ، تشخیص و ارزیابی فلزات در خاک ها و نمونه های زمین شناسی ، بررسی ترکیبات فنلی در عصاره های گیاهی ، جداسازی آلکالوئیدها ، جداسازی ترکیبات علامت دار به وسیله رادیو ایزوتوپ‌ها ، کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی مواد فرار غیر فعال مانند هیدروکربن‌ها و دیگری جداسازی اسیدهای چرب با فراریت بیشتر مناسب نمی باشد.

نکات بارز کروماتوگرافی کاغذی
روش کروماتوگرافی (صعودی ، نزولی یا افقی)

تصمیم گیری شخص آزمایش‌گر و وسایل موجود در مورد اینکه چه روشی برای یک آزمایش معین باید به کار رود، احتمالا از نکات اولیه است. تناوب خیلی کمی در نتایج به دست آمده از کروماتوگرافی صعودی و نزولی وجود دارد ولی زمان صرف شده متفاوت است. زمان صرف شده عمدتا به نوع حلال و کاغذ بستگی دارد. ولی برای یک مجموعه مشخص کاغذ-حلال روش نزولی سریع‌تر از روش صعودی است. زمان عبور حلال در یک کرومتوگرام نزولی را با بریدن نوار کاغذ به طوری که یک فشردگی در بین مخزن و محل لکه نمونه به وجود آید، می‌توان افزایش داد.
برای جدا سازی‌های دو طرفه یا جدا سازی یک طرفه همزمان (صعودی) تعداد زیادی از نمونه‌های مختلف با همان حلال ، دستگاه قاب مربعی مناسب است. استفاده از ورقه‌ها و مخزن‌های بزرگ‌تر تنها زمانی ضرورت دارد که عبور حلال به مسافت کم برای انجام کروماتوگرافی کافی به نظر نرسد، و در این صورت روش نزولی بهتر خواهد‌ بود. برای جداسازی‌های کمی یا جداسازی‌هایی که در آنها تعادل دیر برقرار می‌شود، به نظر می‌سد که روش نزولی مطلوب باشد، همچنین موقعی که احتیاج به یک آزمایش طولانی باشد این روش بهترین است. زیرا حلال می‌تواند از انتهای کاغذ لبریز شود.

نوع کاغذ

نقش اولیه کاغذ این است که به عنوان نگه دارنده‌ای برای فاز ساکن عمل می‌کند. سرعت عبور فاز متحرک بستگی به گرانروی این فاز داشته و برای یک مخلوط حلال معین ، سرعت بستگی به |ساختار کاغذ|ماهیت فیزیکی کاغذ دارد. اگر برای افزایش چگالی ، الیاف کاغذ نزدیکتر به هم ساخته شوند، مساحت سطح آزاد و اندازه فضاها کاهش می‌یابد و سرعت عبور کم می‌شود. برعکس با ضخیم تر نمودن کاغذ بدون تغییر چگالی ، سرعت عبور افزایش می‌یابد. در انتخاب کاغذ باید تناسبی بین کارایی ماکسیمم و زمان لازم وجود داشته باشد.

انتخاب و تهیه حلال مناسب کروماتوگرافی

حلال متحرک معمولا مخلوطی است که شامل یک جزء اصلی آلی ، آب ، ترکیبات مختلف اضافه شده مانند اسیدها ، بازها یا عوامل کمپلکس کننده برای افزایش حلالیت بعضی از اجسام یا کاهش بعضی دیگر است. ممکن است ضد اکسنده‌ها نیز اضافه شوند. یک حلال معمولا باید ارزان باشد، زیرا غالبا مقدار زیادی از آن مصرف می شود، به طور خالص قابل تهیه باشد، و نباید بیش از حد فرار باشد. زیرا در آن صورت احتیاج به برقراری تعادل با دقت بیشتر است، از طرف دیگر فراریت زیاد باعث می‌شود که حلال از ورقه بعد از آزمایش آسان‌تر خارج می شود و سرعت عبور آن به میزان زیاد تحت تاثیر تغییرات دما نباشد.

تعادل در ظرف انتخاب شده

لازم است بررسی شود که تا چه حد مخلوط حلال اولیه و کاغذ ، قبل از شروع عمل ، باید با محیط در حالت تعادل قرار بگیرند. زمان لازم برای به تعادل رسیدن محیط با حلال بستگی به اندازه مخزن و فراریت حلال دارد. اگر مخلوط‌های خیلی فرار به کار رود، تبخیر از کاغذ سریع‌تر خواهد بود و برقراری تعادل حائز اهمیت است.

تهیه نمونه

نمونه‌های جامد ، مانند خاک‌ها ، یا سلول‌های زیستی یا مواد بافتی را با حلال خیس می‌کنند، یا از بعضی از روش‌های استاندارد استخراج استفاده می‌کنند، نمونه‌های مهم زیادی مانند ادرار یا سایر مایعات زیستی در محیط‌های آبی هستند.

زمان عمل (گسترش) ، و مکان یابی و شناسایی

موفقیت یک جداسازی کروماتوگرافی در نهایت بستگی به فرآیند مکان‌یابی دارد. البته اجسام رنگی به صورت لکه‌های مجزا در آخر آزمایش قابل مشاهده هستند. اجسام بی‌رنگ احتیاج به آشکارسازی شیمیایی یا فیزیکی دارند. کروماتوگرافی‌ها را باید قبل و بعد از اعمال هر روش دیگری به طور عادی زیر نور فرابنفش بررسی کرد. روش فیزیکی که فقط برای مواد رادیواکتیو قابل استفاده هستند، عبارت‌اند از پرتونگاری خودکار و شمارش.
روش‌های شیمیایی آشکارسازی دارای بیشترین اهمیت هستند و واکنشگرهای به کار برده شده را معمولا واکنشگرهای مکان یاب می‌نامند. با انتخاب صحیح واکنشگر ، عمل آشکارسازی و شناسایی را می‌توان به طور همزمان انجام داد. قسمتی از کاغذ را که شامل جسم مجهول است بریده و جسم را با یک حلال مناسب شستشو می‌دهند محلول حاصل را می‌توان به روش شیمیایی بررسی کرد، یا می‌توان یک سری مخلوط را ، که هر کدام از آنها متشکل از جسم شاهد است تهیه نموده و کروماتوگرام آنها را به دست آورد. به جز ماهیت کاغذ و حلال ، عوامل اصلی مؤثر بر جداسازی مواد عبارت ان از: دما ، اندازه ظرف ، زمان عمل و جهت جریان حلال ، موفقیت نهایی آزمایش بستگی به کارایی روش آشکارسازی دارد.

ارزیابی مواد روی کاغذ
مقایسه چشمی لکه :

محلول‌های شاهد ، دارای مقادیر معلومی از جسم مورد نظر هستند، باید از چندین محلول شاهد با غلظت‌های مختلف استفاده شود، هر یک از این محلول‌ها تمام اجزای موجود در محلول مورد آزمایش را داشته باشند. این روش بستگی به استاندارد کردن خیلی دقیق دارد. در صورت استاندارد کردن ، این روش ، مخصوصا در ارزیابی فلزات ، به طور شگفت آوری دقیق می باشد.

اندازه گیری فیزیکی لکه‌های رنگی :

برای اندازه گیری مقدار ماده به کمک انعکاس یا به وسیله عبور نور از آنها می‌توان از طیف سنج‌های نوری به طور مستقیم یا با اندکی تغییر استفاده کرد.

اندازه گیری مساحت لکه :

مساحت لکه متناسب با لگاریتم غلظت ماده در محلول اولیه می‌باشد. اندازه گیری مساحت ، به علت فقدان مرز دقیق مشکل می‌باشد.

اندازه گیری‌های پرتوزای :

ساده ترین راه آشکار سازی اجسام پرتوزای ، بررسی نوار ، و علامت گذاری محل لکه‌ها می‌باشد.

کروماتوگرافی

کروماتوگرافی روش جزء به جزء کردن یک مخلوط براساس قطبیت مولکول ها می باشد.کروماتوگرافی شامل یک فاز متحرک(مخلوط) می باشد که می خواهیم جداسازی نماییم واین مخلوط دریک مایع ویا گاز حل شده است و ازروی یک فاز ساکن عبور می نماید اجسام موجود در مخلوط به علت قطبیت متفاوت با سرعت های مختلف ازروی فاز ساکن می گذرند .
سرعت حرکت هر جزء درمخلوط به چند عامل قطبیت بستگی دارد که مهمترین آنها یک جسم قطبی هم به حلال وهم به فازساکن جاذبه دارد جسمی که کندتر حرکت می کند بیشترین جاذبه رانسبت به فاز ساکن دارد.

کروماتوگرافی انواع گوناگون دارد

ازجمله :
1- کروماتوگرافی ستونی :
که برای جداسازی های فوق العاده حساس مانند جداسازی ویتامین ها ٬ پروتئین ها ٬ وهورمون هابه کار می رود. که باروش های دیگربه آسانی جدا سازی نمی شوند. در این روش فاز ساکن شامل یک ستون شیشه ای یاپلاستیکی است. که باماده ای نظیر آلومینیم اکسید ٬ کلسیم کربنات٬ منیزیم کربنات٬ زغال فعال شده٬ خاک رس٬ ژل ها و یا بسیاری ازترکیبات آلی دیگر پر شده است. اندازه ذرات فازساکن درگستره( 150 تا 200μm ) می باشد. فاز متحرک شامل مخلوط همراه بایک حلال مناسب است که ازبالای ستون اضافه می شود .
2- کروماتوگرافی یونی
: دراین مورد ستون رااز رزین تبادل یون پر می کنند. بابه کاربردن رزین مناسب می توان یون های مثبت ویون های منفی راازهم جدانمود .
3- کروماتوگرافی کاغذی :
دراین روش به جای ستون شیشه ای از نوارهای کاغذی درظرف سربسته استفاده می شود قطره ای ازمخلوط رابرروی کاغذ گذاشته وانتهای کاغذرادرحلال مناسب قرار می دهند حلال براساس خاصیت موئینگی درکاغذ نفوذ نموده وباعث جداسازی اجزاء مخلوط می شود بردیدن چگونگی این نوع کروماتوگرافی دراینجا کلیک نمایید.
4- کروماتوگرافی لایه نازک:
این تکنیک که غالبا درجداسازی مخلوطهای مواد زیست شناختی مختلف به کار می رود بعضی ازتکنیک واصول به کاررفته درکروماتوگرافی ستونی وکاغذی باهم تلفیق شده است .
5- کروماتوگرافی گازی :
یک تکنیک کروماتوگرافی برای تجزیه مایعات فرارومخلوط هایی ازگازهاو بخارات می باشد .گازهای که باید تفکیک شوند همراه با یک گاز بی اثر نظیر هلیم درفاز متحرک حمل می شود.

روش های کروماتوگرافی

دسته ای از روشهای جداسازی هستند که برای جداسازی اجزای نمونه بکار می روند.در این روشها نمونه بین دو فاز مختلف توزیع می شد و در اثر رقابتی که بین فازها برای نمونه وجود دارد عمل جداسازی صورت میگیرد.
نمونه معمولا روی فاز ساکن قرار میگیرد و فاز متحرک از روی فاز ساکن حرکت کرده می خوهد نمونه را با خود ببرد اما فاز ساکن نمی گذارد. رقابت بوجود امده مبنای جداسازیست
فاز ساکن می تواند جامع یا مایع و فاز متحرک می تواند گاز یا مایع باشد
فاز ساکن در حالت جامد باید دارای سطح وسیع باشد. در حات مایع انرا بر سطح یک جامد بی اثر پوشش می دهند.

سمت راست جامد و سمت چپ مایع است
مکانیسم کروماتوگرافی را فاز ساکن تعیین می کند.اگر فاز ساکن جامد باشد مکانیسم جدب سطحی است و اگر مایع باشد مکانیسم تفکیکیست(نمونه بین فاز ساکن و متحرک تقسیم می شد)
کروماتوگرافی به صورت زیر طبقه بندی می شود

زرد رنگ جذب سطحی/قرمز رنگ تفکیکی/ابی مکانیسم تعویض یون

کاغذی paper

ابتدا روی کاغذ مخصوص خطی رسم کرده و یک نقطه از ماده ی مورد نظر روی خط قرار می دهیم(نقطه ی بنفش رنگ)که بهتر است تا حد ممکن کوچک باشدسپس کاغذ را به صورت عمودی در ظرفی حاوی حلال قرار میدهیم.حلال به ارامی از کاغذ بالا میرود. در کروماتو گرافی کاغذی فاز ساکن اب است نه کاغذ(مایع-مایع) فاز ساکن فاز تعیین کننده است که یا اجازه ی حرکت به نمونه می دهد یا نمی دهد و این همان عامل جداسازیست. میزان حرکت لکه ها می تواند اساس اندازه گیری یا شناسایی باشد. برای تشخیص اینکه کدام ماده A است و کدام B از یک سری استاندارد استفاده میشود به شرط انکه بدانیم A وB به کدام دسته از ترکیبات (امینو اسید و...) تعلق دارند.

R = "فاصله ای که جسم طی کرده" تقسیم بر "فاصله ای که حلال طی کرده"
در شرایط ثابت R یک کمیت ثابت است

ظاهر کردن لکه

اگر لکه رنگی باشد راحت دیده میشود اما اگر بیرنگ باشد باید از روشهای زیر استفاده کرد
1- معرفهای شیمیایی : وجود ماده را مشخص میکنند اما باعث میشوند ماده تخریب یا عوض شود مثلا برای اسیدهای امینه از ترکیبات نینهیدرین استفاده می شود که با انها کمپلکس رنگی میدهد
2-لامپ uv : برخی موادفلورسانس میکنند اما اگر ماده فلورسانس نداشت از کاغذ فلورسانس استفاده میکنند به این ترتیب قسمتهایی که لکه وجود دارد فلورسانس نیست. میتوان لکه را مشخص کرد (دور ان خط میکشند) در این روش ماده هم از بین نمی رود
می توان لکه را برید و بعد در حلال انداخت تا ماده در ان حل شود و بعد اقدام به شناسایی ماده کرد البته در این صورت به ماده ی زیادی نیاز دارین و علاوه بر این یافتن حلال مناسب سخت است و حتی گاهی تا 50 سیستم را باید امتحان کرد.
روشهای تجزیه ی کیفی=> شناسایی بعد از جداسازی:
1/مقایسه R مجهول با R مواد معلوم
2/IR و NMR و mass
روشهای تجزیه کمی:
1/طیف سنجی uv
2/اسپکتروسکوپی انعکاسی

لایه نازک

عملیات کروماتوگرافی لایه نازک مانند کاعذ است.
فاز ساکن یک جامد است که به صورت یک لایه ی نازک روی یک صفحه ی فلزی یا شیشه ای قرار گرفته است. این فاز ساکن می تواند سیلیکاژل (SiO2 هیدراته) , الومینا (Al2O3), ÷لی مر و ... باشد
حسن این روش نسبت به کاغذ عمومی تر بودن مواد شیمیایی برای ظاهر کردن لکه ها در این روش است. مثلا ید و اسید سولفوریک که در کروماتوگرافی لایه نازک برای ظاهر کردن لکه ها بکار می روند در کروماتوگرافی کاغذ قابل استفاده نیستند
در این روش می توان محل لکه را تراشید و در حلال انداخت.

کروماتوگرافی کاغذ gas chromatography

فاز ساکن یک مایع است که بر سطح مواد جامد بی اثر پوشش داده شده و درون یک ستون فرار دارد. فاز متحرک نیز یک گاز است.
این کروماتوگرافی به دستگاه نیاز دارد. این دستگاه شامل:
سیلندر گاز بی اثر (Ne _ He)/ ستون جداسازی(separation column) / محل تزریق نمونه(injection port) / اشکارساز (detector) / ثبات (recorder) / هیتر / ترموستات

ستون گاهی چند متر است بنابراین انرا مارپیچ می سازند. محل تزریق و ستون باید گرم شود تا نمونه نیز بخار شده همرا گاز حرکت کند برای از هیتر استفاده می شود. نمونه های جدا شده یکی یکی به اشکارساز میرسند که به صورت یک پیک یا قله در ثبات نشان داده می شود.
زمانی که طول میکشد تا max مقدار جسم از ستون خارج شود را زمان بازداری گویند. حجمی از فاز متحرک که باعث می شود max جسم خارج شود را نیز حجم بازداری می گویند.
V=FT
که F سرعت عبور است.

مقادیر V و T از خصوصیات یک ماده اند و در شرایط ثابت (گاز- دما- فشار-فاز ساکن-طول ستون- اشکارساز و...) ثابت هستند و ارتفاع پیک یا سطح زیر پیک به غلظت بستگی دارد, بنابراین می توان هم تجزیه ی کمی و هم کیفی را انجام داد
منابع:
1-http://daneshnameh.roshd.ir
شیمی عمومی ؛ دکتر غلام رضا قاضی مقدم
شیمی عمومی ؛ بانگرش کاربردی (۲) اسمیت اسموت پرایس
فرهنگ شیمی ؛ دیوید ویلیام آرتور شارپ
/خ