حسگرهای زیستی مبتنی بر آپتامر

آپتامرهای نوکلئیک اسید توجه زیادی را بین دانشمندان به خود جلب کرده و کاربردهای گسترده ای در زمینه های مختلف بدست آورده اند. در این مقاله، پیشرفت‌های اخیر در توسعه حسگرهای زیستی مبتنی بر آپتامر و روش‌های سنجش زیستی بررسی شده است.

چهارشنبه، 24 آذر 1400

تخمین زمان مطالعه:

مترجم : زهرا حاجی احمدی

موارد بیشتر برای شما

انتخاب طبیعی یکی از مکانیسم های اساسی تکامل است که بیش از 150 سال پیش توسط داروین کشف شد. با این حال، اهمیت انتخاب مصنوعی، در شرایط آزمایشگاهی بسیار دیرتر شناخته شد. آپتامرها نمونه ای عالی از مولکول های عملکردی هستند که در شرایط آزمایشگاهی انتخاب شده اند. در سال 1990، دو گروه به طور مستقل انتخاب در شرایط درون شیشه ای (in vitro) را برای جداسازی توالی‌های RNA توسعه دادند که می‌توانست به طور خاص به مولکول‌های هدف متصل شود. این الیگونوکلئوتیدهای RNA عملکردی سپس آپتامر نامیده شدند. بعدها آپتامرهای مبتنی بر DNA نیز یافت شدند. فناوری آپتامر توجه زیادی را در جوامع علمی و صنعتی به خود جلب کرده است. پس از نزدیک به 20 سال تلاش، آپتامرهای DNA و RNA به عنوان اتصال محکم به طیف وسیعی از اهداف (به عنوان مثال، پروتئین ها، پپتیدها، اسیدهای آمینه، داروها، یون های فلزی و حتی سلول های کامل) شناسایی شده اند. آپتامرها اغلب میل ترکیبی بالایی برای اهداف خود دارند که از قابلیت تا شدن آنها در هنگام اتصال به مولکول هدفشان ناشی می شود (یعنی می توانند مولکول های کوچک را در ساختار اسید نوکلئیک خود بگنجانند یا در ساختار ماکرومولکول ها ادغام شوند. آپتامرها به ابزارهای مولکولی مهمی برای تشخیص و درمان تبدیل شده اند. به ویژه، حسگرهای زیستی مبتنی بر آپتامر دارای مزایای بی‌سابقه‌ای در مقایسه با حسگرهای زیستی با استفاده از گیرنده‌های طبیعی مانند آنتی‌بادی‌ها و آنزیم‌ها هستند: اول، آپتامرهای با ویژگی و میل ترکیبی بالا اصولاً می‌توانند در شرایط آزمایشگاهی برای هر هدف معینی انتخاب شوند (از مولکول‌های کوچک گرفته تا پروتئین‌های بزرگ و حتی سلول‌ها)، بنابراین امکان توسعه طیف وسیعی از حسگرهای زیستی مبتنی بر آپتامر را فراهم می‌کند. دوم، آپتامرها پس از انتخاب می توانند با قابلیت تکرارپذیری و خلوص بالا از منابع تجاری سنتز شوند. همچنین، برخلاف آنتی بادی ها یا آنزیم های مبتنی بر پروتئین، آپتامرهای DNA معمولاً از نظر شیمیایی بسیار پایدار هستند. سوم، آپتامرها معمولاً پس از اتصال هدف دچار تغییرات ساختاری قابل توجهی می شوند. این انعطاف پذیری زیادی در طراحی حسگرهای زیستی جدید با حساسیت تشخیص و گزینش پذیری بالا ارائه می دهد. در سال‌های اخیر، درک کامل آپتامرهای نوکلئیک اسید از نظر ویژگی‌های ساختاری و اتصال لیگاندی آن‌ها، توجه زیادی را ایجاد کرده است و منجر به طیف وسیعی از روش‌های سنجش زیستی شده است که بر گیرنده‌های آپتامر متکی هستند.

اهداف حسگرهای زیستی مبتنی بر آپتامر

آپتامرها همچنین به دلیل فرآیند مصنوعی آنها در شرایط دورن شیشه ای (in vitro) بر اساس SELEX "آنتی بادی های شیمیایی" نامیده می شوند. برخلاف تهیه آنتی‌بادی‌ها، که بر القای سیستم ایمنی حیوان متکی است، فرآیند SELEX ساخت آپتامرهایی را برای اهداف غیرایمن‌زا و سمی امکان‌پذیر می‌سازد که در غیر این صورت به دست آوردن آنها توسط سیستم ایمنی غیرممکن است. علاوه بر این، تولید آپتامرها در مناطق خاصی از اهداف نیز امکان پذیر است که گاهی اوقات برای آنتی بادی ها دشوار است، زیرا سیستم ایمنی حیوانی ذاتاً حاوی اپی توپ روی مولکول های هدف است. تا به حال، آپتامرها برای طیف گسترده‌ای از اهداف انتخاب شده‌اند، از جمله یون‌های فلزی (مانند K⁺)، مولکول‌های آلی کوچک (مانند اسیدهای آمینه، ATP، آنتی‌بیوتیک‌ها، ویتامین‌ها و کوکائین)، رنگ‌های آلی، پپتیدها، پروتئین ها (به عنوان مثال ترومبین، فاکتورهای رشد و پپتیدهای مرتبط با HIV) و حتی سلول های کامل یا میکروارگانیسم ها (به عنوان مثال، باکتری ها). مهمتر از همه، در دسترس بودن چنین مجموعه بزرگی از آپتامرها، توسعه ابزارهای سنجش زیستی جدید را در حوزه هایی که شامل تشخیص، ضد بیوتروریسم، و تجزیه و تحلیل محیط و مواد غذایی می شود، ممکن می سازد. آپتامرها اغلب دارای گزینش پذیری و میل ترکیبی بالایی نسبت به اهداف خود هستند. مشابه آنتی ژن ها/آنتی بادی ها، برهمکنش بین آپتامرها و اهداف مولکولی آنها معمولاً آنقدر خاص است که حتی تغییرات کوچک در مولکول هدف ممکن است اتصال آپتامر را مختل کند (به عنوان مثال، آپتامرهای تئوفیلین و ال-آرژینین می توانند ساختارهای شیمیایی نزدیک به هم را متمایز کنند).

انواع مختلف آپتامر

همراه با پیشرفت سریع فناوری‌های تحلیلی مدرن و کاربرد معرف‌های تحلیلی جدید (مانند کاوشگرهای مبتنی بر نانومواد)، فرمت‌های زیست‌سنجی مبتنی بر آپتامر بیشتر و بیشتر در سال‌های اخیر توسعه یافته‌اند. حسگرهای مبتنی بر آپتامر (آپتاسنسورها) توجه خاصی را به خود جلب کرده اند. جدا از مزایای ذاتی حسگرهای زیستی (به عنوان مثال، عدم نیاز به مراحل پردازش اضافی)، حسگرهای زیستی مبتنی بر آپتامر مزیت قابلیت استفاده مجدد را نسبت به آنتی بادی ها ارائه می دهند. علاوه بر این، اندازه کوچک و تطبیق پذیری آنها امکان تثبیت کارآمد در تراکم بالا را فراهم می کند، که در چند کارکردی کردن سیستم های کوچک شده (به عنوان مثال، آرایه های زیستی یا بیوتراشه ها) اهمیت حیاتی دارد. در این بررسی، سنجش‌های زیستی مبتنی بر آپتامر با توجه به روش دریافت سیگنال، به‌ دو گروه الکتروشیمیایی و نوری طبقه‌بندی می‌شوند.

الکتروشیمیایی

آپتامرهای نوکلئیک اسیدها زنجیره‌های منعطف و تک رشته‌ای خود را پس از اتصال به مولکول‌های هدف خود به ساختارهای سه‌بعدی کاملاً مشخص می‌پیوندند، بنابراین، به شرطی که آپتامرها بر روی یک تکیه‌گاه رسانا تثبیت شوند، این رفتار واکنش های اکسایش و کاهش (ردوکس) را فعال می‌کند. بخش‌هایی که باید به آن‌ها متصل شوند و شناسایی تشکیل کمپلکس‌های آپتامر-هدف با بررسی ویژگی‌های انتقال الکترون صورت می گیرد. چندین آپتاسنسور الکتروشیمیایی بر اساس این استراتژی توسعه داده شده است. یک رویکرد بهبودیافته متکی بر استفاده از پروب‌های DNA دوبلکس مونتاژ شده روی الکترودهای طلا (Au) هم بکار گرفته شده است که ساختار DNA شامل دو حوزه دو رشته‌ای است که توسط یک پل اسید نوکلئیک غیر مکمل از هم جدا شده‌اند. دمین بالایی توسط یک توالی آپتامر ضد ترومبین با توالی مکمل با برچسب متیلن بلو (MB) تشکیل شد. در حضور ترومبین، تشکیل ساختار G-quadruplex را القا کرد و زنجیره برچسب‌دار MB را آزاد کرد که می‌توانست آزادانه با الکترود تماس برقرار کند. سایر قالب‌های سنجش از واحدهای گزارش‌دهی فعال ردوکس استفاده می‌کردند که به‌صورت کووالانسی به آپتامرها متصل نبودند. این قالب‌ها یک روش «بدون برچسب» را برای نظارت الکتروشیمیایی بر تعامل آپتامر-هدف ارائه کردند. یک رویکرد مرتبط با استفاده از MB intercalative برای تشخیص ترومبین. MB در دمین DNA دو رشته‌ای یک پیکربندی سنجاق سر که حاوی آپتامر ضد ترومبین بود، قرار گرفت. اتصال ترومبین با واحد آپتامر، ساختار سنجاق سر را باز کرد، در نتیجه MB درهم شده آزاد شد. در نتیجه، پاسخ آمپرومتریک در راستای افزودن ترومبین کاهش یافت. معمولاً از خواص بیوکاتالیستی آنزیم ها برای شناسایی و تقویت تجزیه و تحلیل اهداف با آپتامرهایشان استفاده می شود. در یک روش بهبود یافته، نانوذرات (به عنوان مثال، AuNPs) به عنوان حامل برای تشخیص الکتروشیمیایی فوق حساس پروتئین ها استفاده شده اند. در این قالب، AuNP ها با آپتامرهای ضد ترومبین حاوی توالی پلی آدنین (poly-A) عامل دار شدند. آنها به ترومبین جذب شده توسط آنتی بادی ضد ترومبین بی حرکت متصل می شوند. نوکلئوبازهای آدنین با تجزیه اسید یا نوکلئاز آزاد شدند و مستقیماً با استفاده از الکترود گرافیت پیرولیتیک شناسایی شدند. از آنجایی که یک NP دارای تعداد زیادی آپتامر بود، فرآیند اتصال ترومبین به طور قابل توجهی تقویت شد.

نوری

آپتامرها همچنین به طور گسترده ای به عنوان عناصر شناسایی زیستی در سنجش های زیستی نوری استفاده شده اند. از بین این فرمت‌های سنجش، فلورسانس و رنگ‌سنجی دو تکنیک محبوب هستند. تشخیص فلورسنت به دلیل سهولت برچسب زدن آپتامرها با رنگ های فلورسنت، در دسترس بودن بسیاری از فلوروفورها و خاموش کننده های مختلف و قابلیت ذاتی برای تشخیص سریع، به طور گسترده ای مورد استفاده قرار می گیرد. چندین استراتژی اصلی برای تبدیل آپتامرها به پروب های سیگنال دهی فلورسنت که اغلب آپتامرهای سیگنالینگ نامیده می شوند، ایجاد شده است. قالبی که اغلب مورد استفاده قرار می گیرد، یک فانوس مولکولی مبتنی بر آپتامر (aptabeacon) است که نسخه اصلاح شده ای از فانوس های مولکولی سنتی بود. یک توالی آپتامر را در یک ساختار مولکولی فانوس مانند و سنجاق سر قرار می دهد که انتهای آن با یک فلوروفور و یک خاموش کننده برچسب گذاری شده است. اتصال هدف، ساقه را مختل ، فلوروفور را از خاموش کننده جدا می کند و منجر به سیگنال های فلورسانس می شود. فرمت دیگری که اغلب به تصویب می رسد یک آپتامر نشاندار شده با فلوروفور را در یک ساختار دوبلکس با یک توالی DNA مکمل که با یک خاموش کننده برچسب گذاری شده است، قرار می دهد. وجود اهداف باعث خروج رشته مکمل از آپتامر می شود که با افزایش فلورسانس همراه است. تا به امروز، فرمت‌های سنجش مبتنی بر فرونشاندن فلورسانس، فقط به سنجش زیستی کیفی یا نیمه کمی اجازه داده‌اند. اخیراً، به جای استفاده از رنگ‌های فلورسنت آلی، از نقاط کوانتومی (QDs) برای بهبود عملکرد سنجش آن‌ها و برای تشخیص تحویل دارو در سلول‌ها استفاده شده است. یک فرمت جایگزین استفاده از انتقال رزونانس فلورسانس (FRET) است که بر انتقال انرژی بین دو مولکول فلورسنت دهنده و گیرنده متکی است. با این حال، علیرغم تلاش‌های زیادی که در حال حاضر برای بهینه‌سازی الیگونوکلئوتیدهای دارای برچسب دوگانه انجام می‌شود، پیشرفت کمی در یک کاوشگر کمی با استفاده از تکنیک FRET انجام شده است. این احتمالاً به این دلیل است که بهبود FRET به عوامل زیادی بستگی دارد (به عنوان مثال، ماهیت رنگ‌ها). مهمتر از آن، کاوشگرهای مبتنی بر خاموش کننده فلورسانس یا FRET به دلیل تداخل سیگنال پس زمینه، به سختی می توانند مستقیماً برای تجزیه و تحلیل اهداف در محیط های اصلی خود اعمال شوند. در یک روش جدید، یک آپتامر با تغییر طول موج برای تشخیص سریع و حساس به PDGF طراحی شد. آپتامر متصل به یک pyrene در هر انتها، انتشار فلورسانس خود را از 400 نانومتر (مونومر پیرن، با طول عمر فلورسانس 5 نان ثانیه) به 485 نانومتر (اگزایمر پیرن، با طول عمر 40 نانو ثانیه) با اتصال PDGF6 تغییر می‌دهد. در نتیجه، این طرح مشکل مهم سیگنال پس‌زمینه ذاتی در نمونه‌های بیولوژیکی پیچیده را رفع کرد. اخیراً توجه زیادی به استفاده از نانومواد (به عنوان مثال، AuNPs) شده است که امکان توسعه قالب‌های زیست سنجش رنگی ساده را فراهم می‌کند. در یکی از این روش ها، AuNP های اصلاح نشده برای تمایز DNA باز و تا شده استفاده شد. که یک رویکرد جدید برای کاوش فرآیندهای تشخیص زیستی مبتنی بر آپتامر به صورت رنگ سنجی ارائه کرد. آپتامر DNA به شکل یک مارپیچ در هم تنیده در محلول است که می تواند محکم به AuNP ها متصل شود و آنها را در برابر تجمع ناشی از نمک تثبیت کند. پس از اتصال به هدف خود، آپتامر ساختارهای سه بعدی را تشکیل داد (به عنوان مثال، کوارتت G) و دیگر از AuNP ها در برابر تجمع محافظت نکرد. سپس، تغییرات رنگی AuNP های اصلاح نشده با چشم غیر مسلح قابل مشاهده است. تا به امروز، این استراتژی سنجش با موفقیت برای تشخیص یون پتاسیم و پروتئین ها اعمال شده است. آپتامرها نیز اخیراً برای مونتاژ NPها و انجام سنجش‌های زیستی به کار گرفته شده‌اند. در یک مطالعه مرتبط، آپتامرها به عنوان پیوند دهنده برای مونتاژ AuNP های دارای گروه عاملی ssDNA استفاده شدند. در حضور مولکول های هدف، آپتامر ساختار خود را تغییر داد و NP ها جدا شدند. در نتیجه، ترکیب بنفش رنگ به NP های جداگانه قرمز رنگ تبدیل شدند. این فرمت سنجش می تواند برای تجزیه و تحلیل طیف وسیعی از مولکول ها با جایگزینی ساده توالی آپتامر استفاده شود. از آن برای تشخیص آدنوزین و کوکائین در سرم با یک آزمایش ساده استفاده شده است. اخیراً، سیستم AuNP مرتبط با آپتامر به طور سیستماتیک مورد بررسی قرار گرفته و با سیستم‌های آپتامر-بیکن مقایسه شده است. در طرح سنجش دیگری، ابتدا یک آپتامر DNA با یک ssDNA مکمل کوتاه که روی AuNP ها که به خوبی در محلول پراکنده شده بود و قرمز به نظر می رسید هیبرید شد. پس از اتصال هدف، رشته‌های آپتامر تحت یک رویداد تغییر ساختار قرار گرفتند که منجر به جدا شدن آنها از AuNP شد. AuNP های هیبرید نشده در همان غلظت نمک ناپایدار بودند و بلافاصله جمع شدند که منجر به تغییر رنگ سریع قرمز تا بنفش شد. AuNP های عامل دار با آپتامرها نیز برای تشخیص نوری تقویت شده پروتئین ها در پیکربندی ساندویچ استفاده شده اند. آپتامر ضد ترومبین به صورت کووالانسی به یک تک لایه سیلوکسان عاملدار با مالئیمید (Maleimide) متصل گردید و بدین ترتیب ترومبین به رابط متصل شد. سپس همان AuNPهای عاملدار شده با آپتامر به دومین محل اتصال ترومبین مرتبط شدند. سپس رابط AuNP حاصل در محلول رشد حاوی HAuCl₄ و عوامل کاهنده، بزرگ شد. بزرگ شدن AuNP ها به طور قابل توجهی حساسیت تشخیص رنگ سنجی را بهبود بخشید، که می توانست ترومبین 2 نانومولار را تشخیص دهد.

جمع بندی

در این مقاله، مروری بر پیشرفت های اخیر در توسعه و کاربرد حسگرهای مبتنی بر آپتامر نمود. در حالیکه چنین آپتاسنسورهایی تنها حدود ده سال است که ظاهر شدند، ولی کاربردهای گسترده ای در تحقیقات پایه و تشخیص های زیست پزشکی پیدا کرده اند. طیف وسیعی از مبدل ها (به عنوان مثال الکتروشیمیایی و نوری) در آپتاسنسورها استفاده شده است. با وجود این پیشرفت‌های سریع، سنجش‌های زیستی مبتنی بر آپتامر در مقایسه با روش‌های ایمنی هنوز نابالغ هستند، که به نوعی نشان‌دهنده محدودیت دسترسی به انواع آپتامر و دانش نسبتا ضعیف فناوری‌های تثبیت سطحی برای آپتامرها است. نانوتکنولوژی کمک بزرگی به روش های تحلیلی و تشخیصی کرده است (به عنوان مثال، ترکیب آپتامرها با نانومواد جدید منجر به ایجاد آپتاسنسورهای بسیار حساس و انتخابی شده است). به طور خلاصه، در حالی که هنوز راه زیادی در پیش است، ما انتظار داریم که حسگرهای زیستی مبتنی بر آپتامر در نهایت به ابزارهایی در دنیای واقعی تبدیل شوند که بتوانند با چالش‌هایی مواجه شوند که فناوری‌های موجود فعلی توانایی مقابله با آن ها را ندارند.

منبع: شیپینگ سانگ، Chinese Academy of Sciences