تعداد آزمایش‌های مزرعه‌ای برای گیاهان تراریخته که شامل تحمل به خشکی است در حال افزایش است. مشخص شده است که برای استقرار موفقیت آمیز چنین فناوری در این زمینه، زیست شناسان مولکولی نیاز به همکاری نزدیک با فیزیولوژیست ها و پرورش دهندگان نباتات دارند تا صفات مورد نیاز تحت سیستم کشت خاص مورد نظر را درک کنند. در این مقاله، رویکردهای مورد استفاده برای شناسایی ژن‌های تحمل به خشکی و برجسته کردن ژن‌های امیدوارکننده برای مهندسی تحمل به خشکی در محصولات کشاورزی شرح داده شده است.
آرابیدوپسیس به عنوان یک سیستم مدل برای کشف عملکرد ژن
همانطور که در بالا توضیح داده شد، تعیین توالی ژنوم آرابیدوپسیس یک صنعت کشف عملکرد ژنی با توان عملیاتی بالا ایجاد کرد. مناسب بودن آرابیدوپسیس به عنوان ارگانیسم مدل برای تحقیقات آزمایشگاهی به خوبی ثابت شده است. تحقیقات روی خانواده فاکتورهای رونویسی CBF/DREB نشان داده است که تنظیم‌کننده‌های ژنی پاسخ‌دهنده به خشکی و سرما بین گونه‌های کاملاً متفاوت مانند آرابیدوپسیس و برنج حفظ می‌شوند.علاوه بر این، پروتئین های ساختاری مانند کانال های یونی نیز حفظ می شوند. در این موارد، ژن‌های کشف‌شده در آرابیدوپسیس هنگامی که به گونه‌های دیگر منتقل می‌شوند، همان ویژگی‌ها را ایجاد می‌کنند. چندین ویژگی آرابیدوپسیس آن را به عنوان ارگانیسم مدل مطرح می کند: سهولت تغییر شکل، اندازه کوچک و چرخه عمر کوتاه. تعدادی از رویکردها برای کشف عملکرد ژن در آرابیدوپسیس وجود دارد. در بیشتر موارد، صنعت agbiotech تولید جمعیت بزرگی از خطوط حاوی یک ژن تراریخته منفرد را انتخاب کرده است. مطالعات ژنتیک کلاسیک یا پیشرو با یک فنوتیپ جهش یافته شروع می شود و به سمت شناسایی ژن کار می کند.
توالی یابی ژنوم، رویکردهای ژنتیک معکوس را که با یک ژن شروع می شود و به سمت عملکرد ژنی کار می کند، عملی تر کرده است. کشف عملکرد ژن در این مطالعات به تغییر فعالیت ژن بستگی دارد. کاهش فعالیت ژن را می توان با چندین روش انجام داد، از جمله: جهش زایی شیمیایی یا جهش به کمک پرتوتابی (اشعه ایکس، نوترون، پرتو گاما)، جهش زایی درج (T-DNA یا ترانسپوزون)، بیان آنتی سنس یا RNA مداخله گر (RNAi).
از بین این روش‌ها، جهش‌زایی درج T-DNA عملی‌ترین رویکرد در گیاهان بوده است. مجموعه‌های بزرگی از جمعیت‌های جهش‌یافته آرابیدوپسیس در دسترس عموم هستند و بیش از 75 درصد از حدود 30000 ژن موجود در آرابیدوپسیس ترسیم شده است. رایج ترین رویکرد برای تغییر فعالیت ژن در بیوتکنولوژی، بیان بیش از حد ژن مورد نظر است.
این مورد معمولاً با انتقال ژن گیاهان با سازه هایی انجام می شود که بیان ژن مورد نظر توسط یک پروموتر با بیان بالا هدایت می شود. به طور معمول از پروموتر 35S استفاده می شود، اما پروموترهای اختصاصی بافت و القایی نیز استفاده می شود.
ژن هایی که شناسایی شده اند
چندین بررسی اخیر فهرست جامعی از ژن‌هایی را ارائه کرده‌اند که نشان داده شده‌اند در صورت جهش در آن ها، تحمل به خشکی را نشان می‌دهند. این پروتئین ها عملکردهای مختلفی از جمله: تنظیم رونویسی، انتقال سیگنال (پیام)، حفاظت از خشک شدن، سنتز اسمولیت ها، آنزیم های حذف کننده ROS و بیوسنتز و انتقال سیگنال ABA دارند.علاوه بر این، ژن‌های دخیل در الگوی اپیدرمی و بیوژنز کوتیکول نیز با تحمل به خشکی مرتبط هستند. در بیشتر موارد، شواهدی که نشان می‌دهد این ژن‌ها تحمل به خشکی را اعطا می‌کنند بر اساس گیاهان آزمایشگاهی تحت شرایط خشکسالی مصنوعی است. بنابراین، یک سوال کلیدی این است که آیا بیان این ژن ها در گونه های محصولات هدف باعث افزایش زیست توده یا عملکرد در شرایط خشکسالی طبیعی در مزرعه می شود یا خیر.
سیگنالینگ (پیامرسانی) ABA
بسیاری از رویکردهای تراریخته برای مهندسی تحمل به خشکی بر اجزای مسیر سیگنالینگ ABA از جمله بیوسنتز ABA متمرکز شده‌اند. سیگنال دهی ABA بر بیان ژن های پاسخگو به استرس تأثیر می گذارد و منجر به کاهش رسانایی روزنه ای از طریق اثر مستقیم بر کانال های آنیون سلول نگهبان روزنه می شود.کاهش تلفات آب تعرق منجر به پژمردگی تاخیری در سنجش کوتاه مدت خشک شدن و بازیابی می شود. با این حال، صرفاً کاهش رسانایی روزنه‌ای ممکن است یک رویکرد عملی برای اعطای زیست توده و عملکرد در شرایط محدودکننده آب در مزرعه به دلیل ارتباط تنگاتنگ رسانایی روزنه‌ای و بهره‌وری فتوسنتزی نباشد.
با این وجود، مزایای بیان ژن ناشی از ABA را می توان بدون تأثیر بر هدایت روزنه ای به دست آورد. یک راه ساده برای افزایش سیگنال دهی ABA، افزایش بیوسنتز ABA است. در این راستا، تعدادی از مطالعات با بیان بیش از حد 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED) (یک آنزیم حیاتی در مسیر بیوسنتز ABA) پرداخته‌اند.
بیان بیش از حد NCED در گوجه فرنگی، آرابیدوپسیس و تنباکو انجام شده است. در هر مورد، گیاهان تراریخته کاهش اتلاف آب تعرق و کاهش پژمردگی را در سنجش خشک شدن نشان دادند.
انتقال سیگنال و تنظیم ژن
در چند سال گذشته، مطالب زیادی در مورد فاکتورهای رونویسی (TFs) که بیان ژن پاسخگو به خشکی را تنظیم می کنند، آموخته شده است. این TF ها از چندین خانواده از جمله DREB/CBF، AP2/ERF، bZIP، MYB/MYC، Cys2His2- type zinc-finger و NAC می آیند.ولی آبشار انتقال سیگنال بالادستی که این TF ها را فعال می کند، نسبتاً کمتر شناخته شده است. با این وجود، بیان جهش در چندین مولفه انتقال سیگنال نشان داده شده است که تحمل به خشکی را ایجاد می کند. در این بخش، هم TF ها و هم اجزای انتقال سیگنال را که در مطالعات پیشرفته خشکسالی آزمایش شده اند، بررسی خواهیم کرد.
آبشارهای پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن (MAPK) به دلیل فعال شدن توسط H2O2 و نقش آن ها در تنظیم بیان ژن پاسخگو به استرس، اهداف مورد توجه محققین بوده است. اخیراً NPK1، یک MAPKKK تنباکو، که توسط یک پروموتر 35S اصلاح شده است، در یک سنجش خشکسالی مزمن مورد آزمایش قرار گرفت. سطح رطوبت خاک گیاهان ذرت کشت شده در گلدان به ترتیب در 25% یا 100% ظرفیت نگهداری برای کنترل‌های تحت تیمار با خشکی و آبیاری خوب حفظ شد.
اندازه گیری عملکرد گیاه شامل سرعت فتوسنتزی، زمان بلوغ، تعداد برگ، تعداد دانه و وزن دانه بود. در تمام موارد، گیاهان بیان کننده NPK1 در شرایط خشکسالی بدون کاهش عملکرد قابل توجهی در شرایط آبیاری خوب، بهتر از شاهدها عمل کردند. مطالعات قبلی که شامل بیان بیش از حد NPK1 در تنباکو بود، تحمل به تنش‌های متعدد (انجماد، گرما و نمک) را در سنجش‌ها نشان داد. شاید مهمترین هدف ژنی مورد مطالعه در این دسته DREB1A باشد، عضوی از خانواده CBF/DREB از TFها که نشان داده شده است ژن های تحمل به خشکی را فعال می کند.
این ژن و پارالوگ های آن در آرابیدوپسیس کشف شد که در آرابیدوپسیس ، ذرت، گوجه‌فرنگی، تنباکو، گندم و برنج بیان شده است. این موضوع بیانگر قابلیت انتقال فنوتیپ آرابیدوپسیس به سایر گونه‌های دولپه‌ای و تک لپه‌ای است.
در آزمایش‌های اولیه، بیان بیش از حد سازنده این ژن‌ها باعث کاهش رشد فنوتیپ‌ها شد که نه تنها ارزیابی تحمل تنش را چالش‌برانگیز می‌کرد، بلکه مانع از هرگونه کاربرد عملی فناوری برای محصولات کشاورزی می‌شد. بیان ژن تحت کنترل محرک های القا کننده خشکسالی مانند rd29A، منجر به گیاهانی شده است که از نظر مورفولوژیکی نرمال هستند، اما تحمل به تنش را افزایش می دهند. این فرضیه با مشاهده اینکه در شرایط بدون تنش، بیان ژن تراریخته به صورت محدود مشاهده شد در حالیکه بیان آن به صورت قوی تحت شرایط تنش مشاهده گردید، پشتیبانی می‌شود. ذرت تراریخته بیان‌کننده NF-YB در آزمایش‌های مزرعه‌ای در شرایط خشکی، باعث کاهش پژمردگی وافزایش عملکرد شد.
در شرایط عادی نیز باعث کاهش آسیب تنش اکسیداتیو و افزایش محتوای کلروفیل شد. این ژن ممکن است با افزایش عملکرد کلروپلاست تحمل به خشکی را ایجاد کند.
اسمولیت ها، املاح سازگار، پروتئین های محافظ
ترهالوز، مانیتول، فروکتان ها، گلیسین بتائین و پرولین از جمله متابولیت هایی هستند که به عنوان املاح سازگار با ظرفیت محافظت از سلول ها در برابر آسیب کم آبی در نظر گرفته می شوند. تحقیقات فراوانی برای مهندسی تحمل به خشکی از طریق افزایش تجمع املاح سازگار انجام شده است.این تلاش‌ها علی‌رغم فقدان درک دقیق از نحوه عملکردشان ادامه داشته است. این ایده که این املاح تحمل تنش را از طریق تنظیم اسمزی و افزایش جذب آب ایجاد می کنند، بحث برانگیز است. نقش محتمل‌تر املاح سازگار در تحمل استرس شامل تثبیت ساختارهای بیولوژیکی و ماکرومولکولی، حذف گونه‌های فعال اکسیژن یا اصلاح متابولیسم کربن است. در واقع، زمانی که املاح سازگار به سطوح مورد نیاز برای تنظیم اسمزی انباشته می شوند، رشد گیاه معمولاً متوقف می شود.
در این بخش، سه مطالعه موردی برای ترهالوز، مانیتول و HVA1 (یک پروتئین خانواده LEA) از جو بررسی شده است. ترهالوز (یک دی ساکارید غیر احیاکننده گلوکز)، به دلیل تجمع آن در شرایط تنش در گونه های مختلف از مخمرها، باکتری ها و بی مهرگان، برای مهندسی تحمل به خشکی جلب توجه نموده است. ترهالوز در اکثر گیاهان به استثنای گونه های مقاوم به خشکی مانند Selaginella lepidophylla در سطوح قابل تشخیص تجمع نمی یابد.
با این حال، بسیاری از ژنوم های گیاهی حاوی آنزیم های لازم برای سنتز ترهالوز هستند. ترهالوز در دو مرحله سنتز می شود. ترهالوز-6-فسفات سنتاز (TPS) ترکیب UDP-گلوکز و گلوکز-6-فسفات را کاتالیز می کند و ترهالوز-6-فسفات را ایجاد می کند که سپس با اثر ترهالوز-6-فسفات فسفاتاز (TPP) به ترهالوز تبدیل می شود. یک رقم برنج ایندیکا را با یک ژن همجوشی مشتق شده از نواحی کد کننده E. coli otsA (TPS) و otsB (TPP) که توسط یک پروموتر القایی با ABA یا یک پروموتر تنظیم شده با نور هدایت می شود، تراریخته کرده اند.
لاین های تراریخته تحت دو چرخه خشک شدن و بازیابی برای اعمال تنش خشکی در آزمایشگاه قرار گرفتند و تحمل با علائم قابل مشاهده (تا خوردن برگ و پژمردگی) و همچنین اندازه گیری فعالیت فتوسنتزی (بازده کوانتومی فتوشیمی PSII و Fv/Fm) اندازه گیری شد.
هر دو ساختار تراریخته القایی با ABA و القای نور، کاهش قابل توجهی در علائم استرس و حفظ فعالیت فتوسنتزی ایجاد کردند. مانیتول یکی دیگر از املاح سازگار با مطالعه گسترده است که در بسیاری از گونه های گیاهی وجود دارد و در پاسخ به تنش آبی افزایش می یابد. مانیتول از اثر مانیتول-1-فسفات دهیدروژناز تولید می شود که فروکتوز-6-فسفات را به مانیتول-1-فسفات تبدیل می کند. مانیتول-1-فسفات توسط فسفاتازهای غیر اختصاصی به مانیتول تبدیل می شود.
بیان E. coli mtl1D توسط پروموتر ubi1 ذرت در گندم نشان داده شده است که تحمل به خشکی را افزایش می دهد. گیاهان بیان‌کننده Mtl1D کمبود آب را بهتر از شاهدهای غیرتراریخته تحمل نمودند. با این حال، تجمع مانیتول اندک بود و هیچ تفاوتی در پتانسیل اسمزی بین تراریخته ها و گروه های شاهد مشاهده نشد که به شدت نشان می دهد که مانیتول تحمل را از طریق تنظیم اسمزی ایجاد نمی کند. بلکه نشان می دهد که مانیتول به عنوان یک حذف کننده یون های هیدروکسیل یا با تثبیت ساختارهای ماکرومولکولی عمل می کند.
HVA1 عضوی از گروه 3 پروتئین های فراوان در اواخر جنین زایی (LEA) از جو است که در پاسخ به استرس تنظیم می شود. بیان بیش از حد HVA1، تحت کنترل پروموتر ubi1 ذرت، در گندم، منجر به افزایش زیست توده ریشه و اندام هوایی و وزن بذر در شرایط کمبود آب متوسط نسبت به شاهد غیر تراریخته شد. ولی در شرایط بدون تنش هیچ تفاوتی بین تراریخته و شاهد مشاهده نشد. در یک تجزیه و تحلیل فیزیولوژیکی دقیق تر، برخی از همان محققان بیان بیش از حد HVA1 را در برنج ارزیابی کردند.
در یک آزمایش خشکی طولانی مدت، HVA1 بیان شده بیش از حد توسط پروموتر Act1 منجر به نگهداری طولانی تر از محتوای آب نسبی برگ، کاهش کمتر زیست توده و کاهش نشت غشایی شد. هیچ تفاوتی در تنظیم اسمزی مشاهده نشد که باعث شد نویسندگان حدس بزنند که HVA1 از طریق حفاظت غشاء عمل می کند.
.jpg "رویکردهای بیوتکنولوژی در تولید محصولات کشاورزی مقاوم به خشکی")
تنش اکسیداتیو
گونه های فعال اکسیژن (ROS) در پاسخ به تنش های متعدد تجمع می یابند و از طریق اکسیداسیون به اجزای سلولی آسیب می رسانند. برای سم زدایی ROS اضافی، گیاهان از آنزیم های مهارکننده مانند سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، آسکوربات پراکسیداز (APX) و کاتالاز (CAT) همراه با آنتی اکسیدان هایی مانند اسید اسکوربیک و گلوتاتیون استفاده می کنند. رویکردهای تراریخته برای افزایش ظرفیت سم زدایی ROS، گیاهانی را با افزایش تحمل به تنش به ارمغان آورده است.منگنز-SOD از Nicotiana plumbaginifolia در یونجه با استفاده از پروموتر 34S بیش از حد بیان شد و به میتوکندری یا کلروپلاست هدف قرار گرفت. در آزمایش‌های خشک کردن کنترل‌شده در آزمایشگاه، گیاهان بیان‌کننده SOD آسیب کمتری به فتوسیستم II، کاهش آسیب غشا و افزایش رشد مجدد ساقه پس از برگ‌زدایی نشان دادند.
در سه سال آزمایش‌های مزرعه‌ای، گیاهان تراریخته به طور مداوم بیشتر (تا دو برابر) زیست توده نسبت به گروه شاهد تولید کردند. متعاقباً، این نویسندگان گیاهان تراریخته حاوی تراریخته‌های میتوکندری و کلروپلاست را ارزیابی کردند و دریافتند که هرمی شدن این دو ساختار منجر به افزایش هم افزایی زیست توده نمی‌شود.
در واقع، با بیان هر دو ژن، بازده زیست توده کاهش یافت. پراکسیداسیون لیپیدی یکی از انواع آسیب های سلولی است که توسط ROS ایجاد می شود. اعضای ابرخانواده آلدوکتوردوکتاز می توانند محصولات تخریب پراکسیدهای لیپیدی را سم زدایی کنند. نشان داده شده است که یکی از اعضای این خانواده از یونجه، آلدوز/آلدئید ردوکتاز (MsALR)، آسیب اکسیداتیو را کاهش می دهد و در صورت بیان بیش از حد در تنباکو، تحمل به تنش خشکی را ایجاد می کند.
گیاهان تراریخته که در آزمایشگاه تحت آزمایش خشک شدن و بازیابی قرار گرفتند، افزایش کارایی فتوسنتزی (Fv/Fm) و کاهش تجمع محصولات تخریب پراکسید لیپید را نشان دادند.
چشم اندازهای آینده
چرا هیچ فناوری مبتنی بر ژن که به تحمل خشکی می پردازد تجاری نشده است؟ یکی از عوامل موثر در این تاخیر، چرخه توسعه محصولات تراریخته است که ممکن است بیش از یک دهه طول بکشد تا تکمیل شود. افزایش تعداد آزمایش‌های صحرایی نشانه خوبی است و ممکن است به زودی شاهد گیاهان تراریخته متحمل به خشکی در بازار باشیم. یکی دیگر از عوامل مؤثر احتمالی، شکست بسیاری از مطالعات مولکولی و ژنتیکی در رسیدگی به این موضوع است که آیا نتایج آزمایشگاهی به تحمل خشکسالی در شرایط مزرعه نیز یکسان است؟رویکردهای بیوتکنولوژی کنونی برای تحمل تنش های محیطی هنوز در مرحله اول خود هستند. استقرار موفقیت آمیز این ابزارها در این زمینه نیازمند رویکردهای پیچیده ای است که میزان، ویژگی بافت و زمان بیان ژن را کنترل می کند. قبلاً دیده‌ایم که استفاده از پروموترهای القاکننده می‌تواند فنوتیپ‌های منفی مرتبط با بیان بیش از حد ژن مورد نظر را کاهش دهد. شناسایی و توسعه مجموعه‌ای از محرک‌ها که قادر به بیان به شیوه‌ای اختصاصی بافت و القایی هستند، احتمالاً برای مهندسی محصولات مقاوم به خشکی ضروری است.
تأثیر خشک شدن بر سلول گیاهی دامنه وسیعی دارد و عوامل و مسیرهای سلولی متعددی در مقابله با این استرس نقش دارند. با این حال، بیشتر تحقیقات تا به امروز شامل بیان ژن های منفرد بوده است. هنگامی که آن ژن منفرد یک TF باشد، یک مجموعه کامل از ژن ها می تواند فعال شود. این مزیت اصلی استفاده از TFs در رویکردهای بیوتکنولوژی است. البته، تأثیر بر تنظیم بسیاری از ژن ها نیز می تواند یک نقطه ضعف باشد و می تواند منجر به اثرات منفی ناخواسته پلیوتروپیک شود.
هنگامی که مسیرهای متابولیک هدف قرار می گیرند، رویکردهای تک ژنی باید با تمایل سیستم های سلولی برای بازگرداندن هموستاز مقابله کنند. مراحل متعددی در مسیر بیوسنتزی باید برای کنترل دقیق‌تر شار متابولیک مهندسی شود. برای پروتئین‌های کاربردی مانند پروتئین‌های LEA که انواع خاصی از آسیب سلولی را کاهش می‌دهند، رویکردهای تک ژنی بهبود تحمل استرس را نشان داده‌اند. حتی سطوح بالاتری از تحمل استرس را ممکن است با ایجاد گیاهانی که در آن ها چندین تراریخته از دسته‌های عملکردی متفاوت بیان شده‌اند، بدست آوریم.
از طرفی، دوره های خشکی اغلب با افزایش گرما همراه است و این ترکیب تنش ها می تواند نیازهای فیزیولوژیکی متناقضی را بر گیاه تحمیل کند. افزایش تعرق برگ یک راه موثر برای دفع گرمای اضافی است، اما در شرایط تنش خشکی پاسخ مناسبی نیست. بنابراین، یک چالش مهم برای بیوتکنولوژی ایجاد شرایط تنش ترکیبی در محیط غربالگری آزمایشگاهی است که به طور صادقانه‌تری شرایط واقعی در مزرعه را نشان دهد.
منبع:
کوری، Ceres, Inc Thousand Oaks
