كارگاه عملي – نظري كلونينگ , نشاندار كردن و هيبريديزاسيون اسيد هاي نوكلئيك(قسمت دوم)
انجام واكنش Ligation:
2- حجم واكنش را در نظر بگيريد ( بهتر است يك ميكروگرم DNA را درواكنشي به حجم 20-30 ميكروليتر انجام گيرد )
3- با آب دوبار تقطير استريل حجم واكنش را تنظيم كنيد
4- واكنش را مدت 5 دقيقه در 45 درجه قرار دهيدتا انتهاهاي Cohesive كاملا" Relax شوند
5- بافر Ligation را با غلظت نهايي 1x استفاده كنيد
6- يك ميكروليتر آنزيم T4 DNA ligase به واكنش اضافه كنيد
7- چند ثانيه آن را spin كنيد
8- مدت 3-2 ساعت در دماي 37 درجه قرار دهيدو سپس واكنش را ترانسفرم كنيد.
18- پيدا كردن كلني هاي حاوي Recombinant DNA:
در اين كارگاه آموزشي از دو روش استفاده ميكنيم
الف ) غير فعال كردن ژن مقاومت به تتراسيكلين پلاسميد pBR322
جايگاه آنزيم BamHI روي سكانس ژن مقاومت به تتراسيكلين پلاسميد pBR322 قرار دارد چنانچه DNA خارجي در جايگاه اين آنزيم كلون شود و پلاسميد نو تركيب در باكتري ترانسفرم گردد ، باكتري نسبت به تتراسيكلين حساس ميشود.Insert DNA مورد استفاده كه قطعه اي از DNA ميتوكندري (kDNA) انگل ليشمانيا ميباشد در حدود 800bp است كه آن را در جايگاه BamHI پلاسميد pBR322 كلون ميكنيم
1- محصول Ligation را درباكتري HB101 ترانسفرم كنيد ( باكتري XL1-blue نسبت به تتراسيكلين مقاوم است و براي اين آزمايش قابل استفاده نميباشد).
2- محصول ترانسفرم شده را روي پليت آگار حاوي آمپي سيلين و بدون تتراسيكلين پخش كنيد.
3- روز بعد يك Master plate حاوي آمپي سيلين و بدون تتراسيكلين تهيه كنيد و آن را شطرنجي نموده و خانه هاي آن را شماره گذاري نماييد سپس كلني هاي حاصل از ترانسفرماسيون شب قبل را داخل خانه هاي شطرنجي (شماره دار) پليت منتقل كنيد.
4- روز بعدنيز آگار پليت مشابه روز قبل تهيه كنيد كه داراي دو آنتي بيوتيك آمپلي سيلين و تتراسيكلين باشد (100μg /ml آمپي سيلين و 12.5μg/ml تتراسيكلين ) و هر كلني را در خانه هم شماره آن روي پليت حاوي تتراسيكلين و آمپي سيلين كشت دهيد
5- روز بعد هر كدام از كلني ها كه رشد نكرد ه باشند حاكي از حساس بود ن آنها به تتراسيكلين ميباشد (قطعه DNA مورد نظردر پلاسميد كلون شده است).
6- كلني باكتري كه رشد نكرده را از روي Master plate شماره 1 ( بدون تتراسيكلين ) پيدا كرده و از آن كشت شبانه تهيه كنيد
پلاسميد آن را استخراج كرده و با آنزيم BamHI آن را برش دهيد ، بعد از الكتروفورز بايد قطعه DNA كلون شده را روي ژل مشاهده كنيد ( تقريبا" 800bp ميباشد ) .
ب) غير فعال كردن ژن LacZ` پلاسميد Bluescript و مشاهده كلني ها ي آبي و سفيد
( alfa- complementation test ) همانطور كه قبلا" گفته شد MCS پلاسميد Bluescript داخل ژن LacZ` تعبيه شده است . سكانس اين ژن قسمتي ازسكانس ژن آنزيم β-galactosidase است , اين آنزيم اثصالات بتا گالاكتوزيدي لاكتوز را تجزيه كرده و لاكتوز را به گلوكز و گالاكتوز تبديل ميكند , همچنين ماده X-gal را كه آنالوگ لاكتوز ميباشد تجزيه كرده و رنگ آبي توليد ميكند. سلولي (باكتري) كه آنزيم بتا گالاكتوزيداز آن ناقص باشد يعني ژن قطعه LacZ` را نداشته باشد چنانچه با پلاسميدي كه سكانس ژن LacZ` داشته باشد ترانسفرم گردد آنزيم بتا گالاكتوزيداز آن كامل ميشود و ميتواند لاكتوز يا X-galرا تجزيه كند. چنانچهinsert DNA درMCS اين پلاسميد كلون شود ژن مذكور غير فعال شده و باكتري نميتواند بعد ترانسفرم شدن با پلاسميد X-gal را تجزيه كند در نتيجه رنگ آبي توليد نميشود و كلني هاي بيرنگ توليد ميشود
A) در سيستم alfa-complementation test. كروموزوم باكتري ژن lacZ ناقص دارد و قسمت N ترمينال(alfa peptide) ژنβ-galactosidase راكد نميكند و محصول ژن فاقداين قسمت ميباشد . ژن lacZ` پلاسميد در داخل باكتري قسمت alfa peptide را كد ميكند و ژن بتا گالاكنوزيداز فانكشنال توليد ميشود كه در حضور X- gal رنگ كلني هاي باكتري آبي ميشود . (b يك قطعه DNA در پلاسميد كلون شده ,ژن lacZ` ناقص شده است ونميتواندX-gal راتجزيه كند در نتيجه كلني هاي باكتري سفيد ميگردند.
1- DNA را در جايگاه آنزيم BamHI يا EcoRI پلاسميد Bluescipt كلون ( Ligate ) كنيد.
2- واكنش Ligation را داخل باكتري XL1- blue ترانسفرم كنيد ( ژنآنزيم β-galactosidase اين باكتري ناقص است و همراه ژن LacZ` پلاسميد Bluescript كامل ميشود اما ژن آنزيم بتا گالاكتوزيداز باكتري HB101 كامل است وبراي اين منظور قابل استفاده نميباشد )
3- باكتري ترانسفرم شده را روي آگار پليت حاوي X-gal و IPTG پخش كنيد ( IPTG يك ماده القاء كننده پروموتور ژن است و موجب بيان آنزيم β-galactosidase ميشود ) .
4- قبل از پخش كردن واكنش روي پليت , به هركدام مقدار 40 ميكروليتر از 20 mM X- gal و 4 ميكروليتر از 200 mg/ml IPTG اضافه كنيد.
5- روز بعد ( 16-12 ساعت ) كلني هاي آبي و سفيد روي پليت آگاررشد ميكنند كه كلني هاي سفيد حاوي Recombinsnt plasmid ميباشند
توجه : اگر پليت حاوي X- gal و IPTG را چند ساعت در 4 درجه قرار دهيد رنگ آبي بخوبي ظاهر ميشود. مركز كلني حاوي ژن بتا گالاكتوزيداز آبي كم رنگ و محيط آن آبي پررنگ است. در مركز كلني هاي سفيد نقطه آبي خيلي كم رنگ ديده ميشود ولي محيط آنها بيرنگ است.كلني هاي سفيد راكشت دهيد و پلاسميد آنهارااستخراج كنيد. پلاسميد را با آنزيم BamHI هضم كنيد بايد بعد از الكتروفورز قطعه DNA كلون شده را روي ژل مشاهده كنيد
19- Polymerase Chain Reaction ( PCR)
واكنش زنجيره اي پليمراز روشي است كه قسمتي از سكانس مولكول DNA كه بين دو پرايمر قرار دارد توسط آنزيم پليمراز وبكمك چهار داكسي نوكلئوتيد تري فسفات در آزمايشگاه تكثير (Amplify) ميشود. .dsDNA متشكل از دو رشته آنتي پارالل ميباشد كه توسط اتصالات هيدروژني وبصورت كووالانت به يكديگر متصل هستند. همانند سازي DNA بكمك اليگو نوكلئو تيد هايي كه پرايمر گفته ميشوند انجام ميگيرد. اليگونوكلئوتيدها مولكولهاي DNA تك رشته كوتاه هستند كه هر كدام از آنها مكمل يك انتهاي سكانس DNA هد ف ( الگو ) مي باشند.پرايمر ها توسط آنزيم DNA پليمراز و در حضور dNTPها از روي DNA الگو ( تك رشته اي است ) همانند سازي ميكنند و رشته هاي جديدي مكمل رشته هاي هدف سنتز ميگردد.
مراحل يك سيكل PCR :
1- مرحله Denaturation : در اين مرحله DNA هدف بر اثر حرارت تك رشته اي ميشود.
2- مرحله Annealing : در اين مرحله با كاهش حرارت سيستم ، پرايمر ها در محل مناسب روي رشته مكمل متصل ميشوند
3- مرحله Extension : در اين مرحله كه دماي آن براي آنزيم DNA پليمرازمطلوب ميباشد موجب توسعه پرايمر ها شده و همانند سازي DNA هدف انجام ميگيرد. محصول PCR عبارت است از قطعه همانند سازي شده اي كه دو طرف اين قطعه سكانس پرايمر ها وجود دارند .
فاكتور هايي كه روي كار آيي PCR تاثير دارند:
1- بعد از 25تا 30 سيكل بعلت حرارت آنزيم دناتوره شده و غير فعال ميشود
2- غلظت زيادرشته هاي هدف موجب Reannealingآنها شده و با پرايمر ها رقابت ميكنند .
روش PCR توسط موليس كارمند شركت Cetus ابداع گرديد. ابتدا اين كار توسط سه بن ماري با حرارت هاي مختلف انجام ميگرفت واز آنريم كلنو بعنوان DNA polymerase استفاده ميشد. اين آنزيم در اثرحرارت دناتوره ميشودو اجبارا"بايد دوباره در هر سيكل به واكنش اضافه شود. Saiki از آنزيم DNA polymerase مقاوم به حرارت كه از باكتري ترموس آكواتيكوس خالص ميشود و اصطلاحا" Taq DNA polymerase گفته ميشود استفاده كرد وامروزه واكنشPCR بصورت اتوماتيك انجام ميگيرد.
پارامتر هاي موثر در PCR :
2- دماي Annealing پرايمرها كه بايد 3-4 درجه كمتر از دماي ذوب پرايمر ها باشد
3- زمانPrimer extension كه به تعداد بازهاي بين دوپرايمر بستگي دارد
4- - تعداد سيكلها
5- Ramp ( زماني كه طول ميكشد تا دماي مبدا دستگاه به دماي مقصد برسد ) هرچه اين زمان كمتر باشد نتيچه كار بهتر است و واكنش زمان كمتري در دماي ناخواسته قرار ميگيرد
6- غلظت dNTP ها و يون منيزيوم ( اينها مجموعه اي را تشكيل ميدهند كه موجب فعاليت آنزيم پليمراز ميشوند و غلظت اين دو ماده تابعي از يكديگر ميباشند )
7- غلظت Template DNA ( يك دهم تا يك ميكروگرم ميباشد ) چنانچه DNA هدف بصورت مالتي كپي در ژنوم باشد بهتر است.
8- اضافه كردن تشديد كننده هاي PCR
10- حذف مها ركننده هاي آنزيم از محيط
11- بهتر نقطه ذوب پرايمر ها (شبيه هم باشد ( Tm يكسان داشته باشند).
20- طراحي پرايمر :
پرايمر ها ي PCR بصورت كاملا" اختصاصي ومكمل ناحيه مورد نظر DNA هدف طراحي ميگردند. پرايمر ها 30-20 بازدارند و پرايمر هاي بيش از 30 باز اختصاصيت خوبي ندارند. همچنين پرايمر بايد دماي آنيلينگ بالا داشته باشد. بهتر است تعداد بازهاي دوپرايمر مساوي باشند و از پلي پورين يا پلي پيريميدين نباشند، همچنين نواحي تكرار شونده نداشته با شند چنانچه بازهاي G يا C بصورت تكراري و پشت سرهم باشند پرايمر بصورت لوپ در مي آيد و عملا" سيستم كار نميكند. انتهاي 3` دو پرايمر نبايد مكمل باشد زيرا پرايمر دايمر تشكيل ميشود.نرم افزارهايي وجود دارد كه طراحي پرايمر را انجام ميدهند. بعد از طراحي پرايمر بهتر است تو سط نرم افزارهايي مانند Blast آنها را چك نمود تا مشخص شود كه با چه ژنهاي ديكر ميتوانندAnneal گردند.در هر سيكل PCR تعداد مولكولهاي DNA دو برابر ميشود. رشته هاي DNA توسط حرارت (95-93درجه ) از يكديگر باز ميشوند ( Denaturing ) و سپس دردوره بعدكه حرارت پايين مي آيد (60-50درجه ) پرايمر ها بصورت اختصاصي به ناحيه هدف متصل ميشوند ( Annealing ). آنزيم Taq DNA polymerase در دماي مطلوب (72درجه ) ودر بافر مخصوص , چهار( dATP, dTTP, dCTP, dGTP ) dNTP را طبق رشته الگو بهم متصل ميكند (Extension ) .لازم به ذكر است كه DNA هاي كوتاه ( Short target product ) يعني رشته هايي كه بين دوپرايمر محصور هستند بصورت تصاعد هندسي (exponential ) و DNA هاي بلند ( long target product ) يعني رشته هايي كه از يك طرف توسط يك پرايمر محدود هستند و از سمت ديگر نامحدود ميباشند بصورت تصاعد حسابي (linearly ) زياد ميشوند .
مواقعي كه پرايمر ها كاملا" مكمل DNA هدف( الگو) نباشند :
1- پرايمر هايي كه براي ايجاد موتاسيون در يك ژن طراحي ميگردند
2- پرايمرهايي كه سمت 5` آنها جايگاه شناسايي آنزيم محدودگر تعبيه ميشود تا بتوان محصول PCR را توسط آن آنزيم برش داد . اين كار براي كلون كردن محصول PCR انجام ميشود.
3- پرايمر هايي كه لازم است محصول PCR آنها داراي پروموتور باشد و براي بيان يك ژن كاربرد دارند
فاصله دو پرايمر بايد كمتر از 10 kb باشد ( كارآيي همانند سازي براي محصول PCR بيش از 3kb كمتر است ) بهتر است پرايمر ها را بر حسب كاري كه لازم داريم طراحي شوند
چگونگي رد يابي ( detect ) محصول PCR :
1- هيبريد شدن محصول PCR با اليگو نوكلئوتيد نشاندار ( پروب )
3- الكتروفورز روي ژل آگارز يا پلي اكريلاميد
انواع PCR ( بمنظور تصحيح محصول ):
1- Hot start PCR : عبارت است از جدا كردن يك يا چند تركيب مهم PCR ( ترجيحا" انزيم پليمراز) بطوريكه بلا فاصله بعد ار دناتوراسيون DNA هدف به واكنش اضافه ميشوند ( استفاده از , PCR gem و آنتي بادي آنزيم پليمراز )
- Hot start بكمك آنتي بادي : مونوكلونال آنتي بادي ضد آنزيم پليمراز را به واكنش اضافه ميكننددرنتيجه فعاليت پليمرازي آنزيم را مهار ميكند. هنگاميكه دماي واكنش به 94 درجه ميرسد آتي بادي دناتوره ميشود و دو باره پليمراز فعال ميشود.
- Hot start بكمك Ampliwax : به ديواره لوله هاي محصوص اينكاربه نوعي واكس آغشته است كه بعد از مختصري گرم كردن ذوب شده و روي ئاكنش را ميپوشاند . آنزيم پليمراز را روي واكس قرار ميدهند . در دماي 94 درجه اين واكس بخار ميشود و آنزيم پليمراز با واكنش تماس پيدا ميكند
2- Touch down PCR : در اين روش دماي آنيلينگ ازدماي بالاتر از Tm بندرت كاهش ميابد وموجب كاهش محصول كاذب و پرايمر دايمر ميشود.
3- Nested PCR : مواقعي كه DNA هدف در نمونه مورد آزمايش كم باشد براي جلوگيري از بالابردن مقدار DNA و مهار واكنش توسط پرايمر هاي خارجي قطعه طويلتري همانند سازي ميشود و از محصول PCR اول كه بيشتر DNA هدف همانند سازي شده است يك واكنش ديگر با پرايمر هاي داخلي انجام ميگيرد. در اين روش اختصاصيت و حساسيت PCR بالا ميرود.
5- Long distance PCR : با اين روش قطعات ببيش از 20 kb همانند سازي ميشوند. براي انجام اين نوع PCR بايد DNA ژنومي از كيفيت بالايي برخوردار باشدو پرايمر ها به دقت طراحي شوند. براي اينكاراز klon taq استفاده ميشود.اين آنزيم نسخه اي از DNA poly است كه قسمت N ترمينال آن حذف شده است و با pfu poly به نسبت 180 به 1 مخلوط ميشود و فاقد 5` اگزو نوكلئازي است
كلونينگ با PCR :
مشكلات : اين جايگاه ممكن است روي قطعه همانند سازي شده نيز وجود داشته باشد.
گاهي اين جايگاه هنگام هضم شدن با آنزيم اشكال ايجاد ميكندكه بايد تعدادي باز به انتهاي 5` پراپمر اضافه شود.
استفاده از جايگاه دو آنريم متفاوت در هضم اشكال ايجاد ميكند.
2- Blunt end ligation : براي اينكار دو انتهاي قطعه همانند سازي شده بايد Polish شود اين كار توسط آنزيمهاي كلنو و T4 DNA polymerase ( پركردن قسمت over hang ) و يا آنزيم هاي S1 nuclease و Mong bean nuclease انجام ميشود
3- - T vector پلاسميد ناقل را با آنزيم EcoRV ويا هر آنزيم ديگركه DNA را بصورت Blunt برش ميدهد هضم ميكنند سپس توسط آنزيم Terminal transferase يا آنزيم Taq poly تعدادي T به انتهاهاي 3` رشته هاي پلاسميد خطي شده اضافه ميكنند .( لازم به ذكراست كه آنزيم Taq poly داراي خاصيت ترمينال ترانسفرازي است و تعدادي A به انتهاي 3` محصول آمپلي فاي شده اضافه ميكند ) . با انجام واكنش Ligation پلاسميد و محصول PCR را بهم متصل ميكنند.
4- توليد نيمه جايگاه شناسايي يك آنزيم برش دهنده در طرف 5` پرايمر. قطعات با T4 poly nucleotidkinase و ATP فسفريله ميشوند و سپس بهم متصل ميگردند ، بعد توسط يك آنزيم هضم شده و كلونينگ انجام ميگيرد .
ايجاد تغيير در محصول PCR :
ميتوان درسمت پايه5`` پرايمر يك پروموتور ويا جايگاه اتصال ريبوروم ( Ribosom Binding Site ) تعبيه نمود، همچنين ميتوان يك Non tanslated leader بين پروموتور و ژن قرار داد تا ناحيه براي شروع سنتز پروتئين مناسب باشد. اين كاربرد بنام Expression PCR گفته ميشود
20- Reverse Transcriptase PCR ( RT- PCR ):
تعدادي از آنزيم هاي پليمراز بجاي DNA از RNA بعنوان سوبسترا استفاده ميكنند واز روي RNA يك رشته DNA سنتز ميكنند. رشته جديد سنتز شده را cDNA ميگويند و واكنش بنام نسخه برداري معكوس Reverse transcription)) گفته ميشود. آنزيمهايي كه ار RNA بعنوان سوبسترا استفاده ميكنند Reverse trnscriptase معروف هستند. آنزيم Tth كه از باكتري ترموس ترموفيلوس بدست مي آيد در حضور يون منگنز فعاليت Reverse trnscriptase و در حضور يون منيزيوم فعاليت DNA polymerase دارد. آنزيم AMV كه از يك نوع ويروس پرندگان بنام Avian Myeloblastosis Virus trnscriptase استخراج ميگردد فعاليت RNase H هم دارد. دماي مطلوب فعاليت آن 42 درجه است و براي تهيه cDNA با طول كمتر از 500 b استفاده ميگردد. آنزيم MMLV ازيك نوع ويروس جوندگان بنام Mouse Molony Leukemia Virus استخراج ميشود و فعاليت RNase H آن كمتر از آنزيم قبلي ميباشد . در 37 درجه فعاليت ميكند . آنزيم Superscript آنزيم MMLV مهندسي شده است كه ژن قسمتي كه فعاليت RNAse H دارد را از آن حذف كرده اند و براي تهيه cDNA بزرگ استفاده ميگردد.
PCR با پرايمر هاي احتمالي (Degeneracy primer):
اين پرايمر ها بر اساس اطلاعات ترادف پروتئين يك ژن طراحي ميشوند و بر اساس اسيد هاي آمينه اي انجام ميگيرد كه داراي يك يا دو كدون باشند.پرايمر هايRAPD - بنام پرايمر هاي اختياري هم گفته ميشوند . اين پرايمر ها پلي مرفيسم را بدون شناخت توالي نوكلئوتيدي رديابي ميكنند
21– استخراج DNA از خون :
1- مقدار 500 ميكروليتر خون ( خون لخته نشده باشد – براي كارهاي PCR از EDTA بعنوان ضد انعقاد استفاده شود زيرا مواد ضد انعقاد ديگر مهار كننده آنزيم پليمراز ميباشند)
2- مقدار يك سي سي از باهر ليز كننده به آن اضافه كرده سانتريفيوژ نماييد
Lysis buffer = 0.33 M sucrose, 10mM Tris , 5mM MgCl2, 1% Triton X-100
3- مايع رويي را دور بريزيد و رسوب خاصل را چندين مرتبه در بافر فوق سوسپانسسيون نموده سانتريفيوژ كنيد تا رسوب بدست آمده شفبف گردد.
4- مقدار 400 ميكروليتر بافر ليز كننده به آن اضافه نموده سوسپانسيون كنيد و مدت 20 دقيقه بجوشانيد.
5- با فنل و كلرفرم آن را استخراج كنيد
6- با الكل آنرا روب داده و در 50 ميكروليتر آب حل كنيد
7- مقدار 2-5 ميكروليتر آن را براي واكنش PCR استفاده كنيد.
22- انچام واكنش PCR
توجه : آزمايش بايد در محلي بدون رفت و آمد انجام گيرد . سمپلر هاي مورد استفاده نبايد براي كارهاي ديگر استفاده شوند ، ظروف، لوله ها و سر سمپلر ها اتو كلاو شوند و هنگام كار از دستكش استفاده شود .
انجام واكنش PCR : مواد زير را داخل لوله مخصوص واكنش PCR بريزيد :
10mMdNTP 0.5 μl (0.1mM)
10x PCR buffer 5 μl
MgCl2 1.5 μl (1.5 mM)
Primer -1 20pmmol
Primer -2 20 pmol
Taq DNA polymerase 0.25 μl ( 1.25 U)
Template DNA 0.1- 1 μg
dH2O up to 50μl
لوله ها را داخل Block دستگاه ترموسايكلر قرار دهيدو دستگاه را روشن كنيد. (مقدار 100 μl روغن معدني روي واكنش بريزيد تا از بخار شدن مواد ممانعت بعمل آورد. لازم به ذكر است كه دستگاههاي ترموسايكلرجديد بصورت Heated lid ساخته شده اند يعني درب دستگاه كه روي لوله هاي واكنش قرار ميگيرد حدود 105 درجه گرم ميشود در نتيجه بالاي لوله گرمتر از پايين آن است و از بخار شدن مواد داخل لوله جلوگيري ميشود). پس از اتمام كار محصول آمپلي فاي شده را با آگارز 3 درصد الكتروفورز كنيد.
.23 - استخراج RNA از سرم:
از دستكش يكبار مصرف استفاده كنيد. تيپ و لوله هاي مورد استفاده را اتوكلاو شوند. در محيط كار و دستها RNase زياد است و RNA زود هيدروليز ميشود لوله , تيپ و مواد و لوازمي كه با RNA در تماس هستند نبايد با دست بدون دستكش تماس پيدا كنند.
1-مقدار 500 ميكروليتر از بافر RNXplus در لوله 5/1 سي سي بريزيد
2- مقدار 100 ميكروليتر از سرم به آن اضافه كنيد و درب لوله رابسته خوب محلوط كنيد
3- مقدار 100 ميكروليتر كلرفرم به آن اضافه كنيد
4- درب لوله رابسته و خوب بهم بزنيد و 2 دقيقه در هواي آزلد قرار دهيد
5- مدت 10 دقيقه با 10هزار دور در دقيقه سانتريفيوژ كنيد
6- مايع شفاف رويي را به لوله جديد منتقل كنيد.
7- دوبرابر حجم آن الكل مطلق اضافه كرده و 10 دقيقه سانتريفيوژ كرده مايع رويي را حذف كنيدو لوله را وارونه روي كاغذ جاذب الرطوبه قرار دهيد
8- مقدار 100 ميكروليتر الكل 75 درجه اضافه كرده سانتريفيوژ كنيد و سپس مايع رويي را خذف كرده و رسوب را خشك كنيد
9- رسوب را در 40 ميكروليتر DEPC treated water حل كنيد
24- انجام RT-PCR:
1- مقدار 10 ميكروليتر از RNA مرحله قبل را RT-PCR استفاده كنيد
RNA 10 μl
RT buffer 4 μl
RT enzyme 0.5 μl
RNasine 0.3 μl
dNTP 1 μl
primer (1&2) 20pmol
DEPC water up to 20 μl
قبل از اضافه كردن RNA مدت 10 دقيقه آن را در 70 درجه قرار دهيد تا از تشكيل لوپ جلوگيري شود. واكنش را يك ساعت در 42 رجه قرار دهيد و سپس 5 دقيقه در 94 قرار دهيد تاRT غير فعال شود وآنزيم پليمراز را مهار نكند. سپس به هر لوله مقدار 0.25 μl آنزيم پليمراز اضافه كنيد و با برنامه زير واكنش را 30 سيكل ادامه دهيد:
Denaturation 94o 30 sec
Annealing 55o 30 sec
Extension 72o 30 sec
براي واكنش Nested مقدار يك ميكروليتر از محصول PCR استفاده كنيد
Taq poly 0.25 μl
10 x PCR buffer 5 μl
Mg Cl2 1.5 μl
Primer (F&R) 3 μl
DNA 1 μl
dH2O up to 50 μl
واكنش را مختصري سانتريفيوژ كنيد وبا برنامه زير واكنش را 30 سيكل ادامه دهيد:
Denaturation 94o 30 sec
Annealing 57o 30 sec
Extension 72o 30 sec
در انتها مدت 5 دقيقه آن را دردماي 72 درجه قرار دهيد واكنش را با ژل آگارز 3 درصد الكتروفورز كنيد ( پرايمرها تعداد 250bp را از ناحيه 5`UTR ويروس هپاتيت C را آمپلي فاي ميكنند.
بايد ها و نبايد ها در PCR
2. اعمال قبل و بعد از PCR جدا از همديگر انجام گيرند
3. براي استفاده ازهر ماده از پيپت جدا گانه و اختصاصي استفاده كنيد
4. از پيپت هايي كه داراي plug هستند و يا از پيپت هاي يكبار مصرف استفاده كنيد
5. مواد ذخيره آزمايشگاه را تقسيم كرده و فريز كنيد و هرچند وقت صحت آنها راكنترل كنيد
6. هنگام استفاده هرلوله را spin كنيد تا موادي كه به اطراف درب لوله چسبيده اند رسوب كنند
7. چند ين كنترل منفي حين آزمايش Run كنيد
8. براي انحام آزمايشهاي تاييدي ازموادفريز شده استفاده كنيد
9. هيشه DNA آمپلي فاي شده را خارج از محل آماده كردن نمونه نگهداري كنيد
10. هنگام كار با PCR product مقداري از آن را جدا گانه نگهداريد
25- آنزيمها ي مورد استفاده درمهندسي ژنتيك
آنزيم هاابزار كار مهندسي ژنتيك در آزمايشگاه ميباشند و مخقق بدون آنها نميتواند كاري انجام دهد. در اين درس با انواع آنزيمها و طرز كار آنها آشناشده و مورد استفاده هر كدام را بررسي ميكنيم.
الف ) ليگازها :
اين آنزيمها اتصال فسفو دي استر بين تك رشته ها را روي رشته DNA تك رشته اي بر قرار ميكند. 5`-p يك رشته به 3`-OH رشته ديگر متصل ميشود.. كو فاكتور آنها ATP يا NAD است .
1- آنزيم DNA ligase : اين آنزيم از باكتري E.coli استخراج مي شود وكوفاكتور آن NAD است و اكثرا" اتصال بين دو DNA كه برش انتهايي ا نها بصورت Cohesive باشد را بر قرار ميكند و عده اي معتقدند كه اين آنزيم در فر قرار كردن اتصال بين دو DNA كه برش انتهايي آنها بصورت blunt باشد مشكل خواهد داشت .
2- آنزيم T4 DNA ligase : اين آنزيم از فاژ T4 استخراج ميشود وكوفاكتور آن ATP است . اين آنزيم اتصال هر دو انتهاي Cohesive و blunt را بر قرارميكند.
3- آنزيم T4 RNA ligase : اين آنزيم اتصال فسفو دي استربين 3`- OH و 5`-P مولكولهاي RNA را بر قرار ميكند . كوفاكتور آن ATP و Mg2+ است
ب) نوكلئاز ها :
اين آنزيم ها نوكلئو تيد هار ا تجزيه ميكنند.
4- آنزيم DNase I : يك اندو نوكلئاز است و dsDNA را به روش غير اختصاصي تجزيه ميكند . كوفاكتور آن Mg2+ ، + Ca2 و Mn2+ است .. اين آنزيم براي مقا صد زير استفاده ميشود:
- تجزيه غير اختصاصي DNA
- نشاندار كردن DNA
- ايجاد موتاسيون در ژن
5- نوكلئاز استافيلوكوكي : DNA و RNA را به روش غير اختصاصي تجزيه ميكند.
6- انزيم RNase A- اين آنزيم RNA تك رشته اي را هيدروليز ميكند.
7- آنزيم RNase H - اين آنزيم RNA را كه با DNA دوبلكس شده باشد راهيدروليزميكند و در سنتز رشته دوم cDNA كاربرد دارد.
8- آنزيم S1 Nuclease : اين آنزيم پلي نوكلئو تيد تك رشته اي را هيدروليز ميكند.
9- آنزيم Mong bean Nuclease – اين آنزيم شبيه S1 Nuclease عمل ميكند
10- آنزيم Exonuclease III (گزو نوكلئاز : (3`→ 5 فعاليت 3` فسفاتاز دارد
همچنين فعاليت شبيه RNase H هم دارددارد.
اين آنزيم اتصال فسفودي استرجايگاههاي آپوريني يا آپيريميديني را تجزيه ميكند
11- آنزيم Bal1 Nuclease : اين آنزيم ssDNA را به روش اگزو نوكلئازي يا اندو نوكلئازي تجزيه ميكند
ج ) آنزيم هاي محدود گر
د) متيلازها
12- فسفاتازها : اين آنزيمها فسفومونواسترازغيراختصاصي هستندكه درpH قليايي فعاليت ميكنند و درحضور پذيرنده هاي فسفات مانند اتانل آمين و Tris بعنوان فسفو ترانسفراز عمل ميكتتد .
فسفاتاز اتصال P--O را تجزيه ميكند ولي فسفوريلاز اتصال C--O را تجزيه ميكند
كاربرد فسفاتاز ها :
دفسفريلاسيون انتهاي فسفات اسيد نوكلئيك
وقتي با پروتئين يا اسيد نوكلئيك كنژوگه شوند بعنوان آنزيم رپورتر عمل ميكند
بعنوان leader در ترشح خارج سلولي و پروتئين هاي فيوژن عمل ميكند
13- آنزيمهاي T4 poly Nucleotid Kinase : اين آنزيمها فسفات γ را از NTP به مولكول پذيرنده (Aceptor) انتقال ميدهد و عبا رتند از:
پروتئين كيناز ها
كربو هيدرات كينازها
پلي نوكلئو تيد كينازها
آنزيم T4 poly nuleotide kinase براي فسفريله كردن يا نشاندار كردن 5`- OH استفاده ميشود ، همچنين براي اندازه گيري فعاليت اندونوكلئازي بكار ميرود.
ه ) DNA پليمرازها : گروهي از آنزيمها هستند هستند كه بكمك چهار نوكلئوتيد تري فسفات (dNTP) از روي رشته الگو يك رشته DNA سنتز ميكنند. اين آنزيمها براي فعاليت خود احتياج به پرايمر دارند. چنانچه داراي فعاليت 3→ 5`` اگزونوكلئازي باشند كار غلط گيري ( proof reading ) را هم انجام ميدهند
14- آنزيم DNA polymerase I :
اين آنزيم داراي فعاليت هاي زير است :
فعاليت 3→ 5`` اگرونوكلئازي
فعاليت 5`→ 3` DNA پليمرازي
فعاليت RNase H
فعاليت نوكلئازي
اين آنزيم براي كارهاي زير استفاده ميشود :
DNA LabelingNick translation
ايجاد انتهاهاي Blunt
15- آنزيم T4 DNA plymerase: يك آنزيم مولتي فانكشنال است وبراي كارهاي زيراستفاده ميشود.
داراي فعاليت DNA پليمرازل
فعاليت 3→ 5`` اگرونوكلئازي
براي PCR هم قابل استفاده است و در 37 درجه فعاليت ميكند
براي ايجاد انتهاهاي Blunt در dsDNA استفاده ميشود
فعاليت 5` نوكلئازي ندارد
16- آنزيم T7 DNA plymerase: اين آنزيم داراي فعاليت 3→ 5`` اگرونوكلئازي ميباشد
Sequenase نسخه اي از اين آنزيم است كه فاقد فعاليت 3→ 5`` اگرونوكلئازي ميباشد وبراي Sequencing استفاده ميشود
سرعت پليمريزاسيون اين آنزيم زياد است و براي سنتز رشته موتاژن در موتاژنزيس بكار ميرود
انتهاي 5`overhang را پر ميكند
17- آنزيم Taq DNA polymerase : اين آنزيم از باكتري گرمادوست ترموس اكواتيكوس استخراج ميشود
فعاليت 3→ 5 اگزو نوكلئازي ندارد
فعاليت 5` نوكلئازي دارد
فعاليت ترمينال ترانسفرازي دارد
آنزيمهاي نسخه بردار معكوس () : گروهي از DNA polymerase ها بنام RNA - dependent DNA polymerase يا Reverse Transcriptase گفته ميشوند اين آنزيمها RNA را الگو قرار داده و DNA مكمل آن را سنتز ميكند و عبارتند از:
18 - آنزيمAvian Myeloblastosis Virus ) AMV) : اين آنزيم از نوعي ويروس استخراج ميشود كه در پرندگان بيماري ايجاد ميكند .
اين آنزيم فعاليت RNase H هم دارد و براي سنتز رشته دوم cDNA استفاده ميشود
19- آنزيم Molony Murine Leukemia Virus ) MLMV) : اين آنزيم از نوعي ويروس استخراج ميشود كه در جوندگان بيماري ايجاد ميكند.
آين آنزيم فعاليت RNase H كمتري از آنزيم AMV دارد
20 – آنزيم ترمينال ترانسفراز :
اين آنزيم پليمريزاسيون dNTP هارا ازروي پايه 3`- OH انجام ميدهد . اين آنزيم براي اتصال نوكلئوتيد ها به انتهاي 3`- OH رشته DNA استفاده ميشود وبراي كلونينگ محصول PCR قابل استفاده است.
21- آ نزيم هاي RNA polymerase :
اين آنزيم ها اطلاعات ژنتيكي را از DNA به RNA منتقل ميكنندو عبارتند از
RNA پليمراز باكتريايي
T7 RNA پليمراز ، يك پروموتور قوي دارد
T3 RNA پليمراز
SP6 RNA پليمراز
22- آنزيم پليمراز A: :
اين آنزيم دم پلي A را سنتز ميكند ودر انتهاي3` رشته mRNA سلولهاي يوكاريوت غير هيستوني يافت ميشود.
اين آنزيم ميتواند RNA هاي polyA منفي را به polyA+ تبديل كندو آنها را بكمك oligo) dT) بعنوان پرايمر، به cDNA تبديل نمايد
23- آنزيم هاي رپورتر / ماركر:
ابن آنزيمها در كلونينگ استفاده ميشوند وچون سريعا" بيان ميشوند براي غربالگري كلني هاي باكتريايي مفيد ميباشند ( آنزيم بتا گالاكتوزيد ازبراي غربالگري توضيح داده ميشود)
ß گالاكتوزيداز - اتصالات گالاكتوزيدي را در اليگو ساكاريد ها هيدروليز ميكند
ß لاكتاماز - اتصالات آميدي را در حلقه ß لاكتام هيدروليز ميكند و پني سيلينوئيك اسيد و سفالوسپوروئيك اسيد توليد ميكنند كه از نظر بيولوژيك غير فعال هستند
-كلرامفنيكل استيل ترانسفراز ( CAT) - كلرامفيكل را غير فعال ميكنند
-لوسيفرازها - آنزيم هاي توليد كننده نور هستند.
آنزيم هاي ( برش دهنده) محدود گر ((Restriction Enzymes
اندو نوكلئازهاي محدود كننده گروهي از DNase ها ميباشند كه توالي نوكلئو تيدي خاصي را شناسايي ميكنند . اين آنزيم ها dsDNA را بصورت اختصاصي يا غير اختصاصي برش ميدهند. اين آنزيم ها اولين بار در دهه 1950 به عنوان سيستم هاي Resriction وModification ( باكتريها براي جلوگيري از حمله باكتريوفاژها و عناصر ژنتيك خارجي اين سيستم ها را بكار مي برند ) كشف شدند. باكتريها توسط سيستم R-M ميتوانند DNA اي را كه از خارج هنگام عفونت ،كنژو گاسيون و ترانسفكشن وارد آنها ميشود را تخريب كنند.سيستم R - M باكتريايي معادل سيستم ايمني پروكاريوتي ميباشد.سيستم هاي R-M كه در ميكرو ارگانيسمها ( باكتريها ) يافت ميشوند بسيار گوناگون ميباشند (حتي در داخل يك سلول ) . تعداد اين آنزيمها از 2100 فراتر رفته و 17 آنزيم نوع I ، 179 آنزيم نوع II و 4 آنزيم از نوع III وهمچنين مشخصات 190 متيل ترانسفراز تغيير دهند DNA تعيين و شناسايي شده است .
سيستم هايR-M دو فعاليت آنزيمي دارند:
الف ) يك اندونوكلئاز (R.ENase) با جايگاه اختصاصي كه مسئول هضم DNA خارجي ميباشد
ب) يك متيلاز تغيير دهنده DNA ( متيل ترانسفراز ) كه همان توالي ويژه را شناسايي ميكند . متيل ترانسفراز ( M.MTase) مسئول تغيير دادن وحفظDNA خودي از هضم شدن توسط R.ENase ميباشد. ممكن است فعاليت R وM در يك آنزيم (واحد) كه داراي چند زير واحد است قرار داشته و يا از نظر فيزيكي آنزيم هاي جداگانه باشند. علي رغم اينكه آنزيم هاي Restriction و Cognate Modifications سكانس مشابه را شناسايي ميكنند، ترادف اسيد آمينه آنها يكسان نيست، شايد اين آنزيم ها با مكانيسم متفاوت DNA هدف را شناسايي ميكنند .
انواع سيستم هاي آنزيمي Restriction - Modification
بر اساس تركيب آنزيم ، كوفاكتورهاي مورد نياز ، قرينگي توالي DNA اي كه شناسايي ميكنند و مشخصات هضم DNA به چهار نوع تقسيم ميشوند. لازم به ذكر است كه گروه متيل دهنده سوبسترا در تمام متيل ترانسفرازها AdoMet ميباشد.
آنزيم هاي R-M نوع I:
مجموعه چند آنزيمي متشكل از زير واحد هاي غير همسان بنام R,M و S ميباشند. زير واحد S اختصاصيت را براي MوR تعيين ميكند. كوفاكتور هاي اين آنزيمها ATP وMg2+ ميباشند و DNA اي كه تغييري در آن ايجاد نشده باشد را در محلي دور از جايگاه شناسايي و تا اندازه اي بصورت احتمالي ( Random ) برش ميدهند . هيدرو ليز ATP قسمتي از فعاليت Restriction اين آنزيم ها ميباشد و بطريق رقابتي با فعاليت اندون.كلئازي خودش جايگاه اختصاصي DNA هدف را متيله ميكنند.
آنزيم هاي R-m نوع II :
اين آنزيمها داراي فعاليت R.ENase و M.MTase جداگانه ميباشند . R.ENase ها دايمر بوده و زير واحد هاي آنها همسان است در صورتيكه M.MTase ها آنزيم هاي مونومر ميباشند . R.ENase هاي نوع II براي فعاليت خود فقط Mg2+ نياز دارند.
R.ENase ها و M.MTase ها تواليهاي اختصاصي نوكلئوتيدي مشابه را شناسايي ميكنند . اكثر R.ENase هاي نوع دوم DNA را ازمحل جايگاه شناسايي برش ميدهند ولي تعدادكمي از آنها كه نوع IIS گفته ميشوند DNA را در فاصله معيني از جايگاه شناسايي برش ميدهند .
آنزيم هاي R-M نوع III:
اين آنزيم ها متشكل از دو زير واحد غير همسان ميباشند كه براي فعاليت رستريكشن به ATPو Mg2+ نياز دارند. اين آنزيم هاتوالي هاي كوتاه غير پاليندرم را شناسايي كرده و DNA را از محلهاي معين (درصورتيكه درجايگاه شناسايي تغييري ايجادنشده باشد )برش ميدهند اين آنزيمها ATP را هيدروليز نميكنند و براي برش دادن DNA به AdoMet ( S-adenosylmethionine)نياز ندارند اما AdoMet موجب تحريك فعاليت اندو نوكلئازي آنهاميشود.
آنزيم هاي نوع IV :
اين آنزيمها از نظر تكاملي بين آنزيم هاي نوع IIوIII ميباشند. اين آنزيمها (مانند Eco571) متشكل از R.ENae و M.MTase جدا گانه ميباشند اما R.ENase كه يك آنزيم مونومر ميباشد فعاليت متيلازهم دارد. اين فعاليت متيلازي قدرت كافي ندارد تا DNA ميزبان را در In vivo محافظت كند.R.ENase و M.MTase توالي هاي ناقرينه را شناسايي ميكنند . R.ENase در حضور Mg2+ در فاصله معيني از جايگاه شناسايي, DNA هدف را برش ميدهد ( مثلا" Eco571 بفاصله 14/16 نوكلئو تيد از محل شناسايي اين كار را انجام ميدهد ) . فعاليت Restriction آنها توسط AdoMet تحريك ميشود.
سيستم هاي Modification يا Restriction مستقل
علاوه بر چهار سيستم آنزيمي كه بحث شد ، بعضي از باكتريها سيستم هاي ديگري مانند سيستم R مستقل از M و سيستم M مستقل از R دارند. يك مقوله اي از سيستم هاي R-M كه در تكنولوژي نو تركيب اهميت بخصوصي دارد Restriction وابسته به Methylation ) MDRS) ميباشد كه R.ENase ترجيحا" DNA را در جايگاههاي متيله برش ميدهد . MDRS متشكل از فرآورده هاي ژني است كه به چندين جايگاه مستقل در ژنوم E.coli K12 مانند mcrA , mcrB و mrr متصل ميباشند. جدول شماره 5- طبقه بندي سيستم هاي R-M
Feature | نوع I | نوع II | نوع III | نوع IV |
ساختمان فعال R-M | يك آنزيم با سه زير واحد (R.M.S) | انزيم هاي جدا گانه | يك آنزيم با دو زير واحد | آنزيم عاي مونومري جدا گانه |
كوفاكتورها | ATPو mg 2+ | mg 2+ | ATPو mg 2+ | (AdoMet) mg 2+ |
جايگاه شناسايي | غير قرينه | پاليندرم غير قرينهه | عير قرينه | غير قرينه |
هضم DNA | فاصله متغير از هر طرف | همان جايگاه به فاصله معيني از طره 3` | 25-27bpاز طرف 3` | 14bpاز طرف3` |
متيلاسيون | دو رشته را بوسيله M متيله ميكند | دو رشته يك متيل ترانسفراز روي هر رشته | فقط يك رشته | دو رشته |
/س
.jpg "5 ابزار ضروری برای زنده ماندن در صعودهای زمستانی")
